Прижизненное исследование животных на бешенство. Исследование на бешенство

Бешенство (Rabies) – инфекционное заболевание, опасное для животных и человека. Данное заболевание встречается во всех странах мира. Характеризуется 100% летальным исходом.

Возбудитель – РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Рабдовирусов. Данный вирус имеет тропность к нервной ткани. В наибольших титрах обнаруживается в головном мозге больных животных. Кроме того, находят вирусы и в спинном мозге, слюнных и слезных железах.
Различают:

1. «дикий» вирус, который циркулирует в естественных условиях и характеризуется высокой патогенностью для человека и животных.
2. И «фиксированный», полученный в лабораторных условиях, не патогенный для животных и человека при экстраневральном введении.

Вирус бешенства не устойчив к высоким температурам: при 60С о инактивируется через 10 минут, при 100С о - почти мгновенно. Но вот в замороженном мозге может сохранять жизнеспособность до нескольких месяцев. Также сохраняется несколько месяцев в гниющих тканях. Устойчив к действию растворов йода. Но быстро инактивируется дезрастворами на основе формалина, хлорамина и щелочи.

Эпизоотологические данные.

К вирусу бешенства восприимчивы все теплокровные. Наибольшей чувствительностью обладают дикие собачьи (такие как: лисицы, песцы, волки, енотовидная собака, шакалы), куньи, грызуны кошки. Менее восприимчивы птицы.

В дикой природе резервуарами вируса бешенства являются хищные животные и летучие мыши, в городе - бродячие собаки.
Источником заражения являются больные животные, у которых вирус выделяется со слюной. Наличие вируса в слюне отмечают уже за 8-10 дней до появления признаков болезни. Заражение происходит при укусе, при попадании слюны на слизистые оболочки или на поврежденные участки кожи.

Патогенез .

После проникновения в организм вирус начинает размножаться в месте внедрения. И через 24 часа начинает проникать в нервную ткань. В нервах он продвигается в направлении спинного и головного мозга со скоростью 7 см/день. Добравшись до мозга вирус начинает усиленно размножаться, затем по нервам вирус попадает во все органы и в первую очередь в слюнные железы и глаза. Инкубационный период (от момента заражения до появления клинических признаков) составляет в среднем 14 – 60 дней, иногда может достигать 6-12 месяцев.
Клинические признаки.

Различают 3 вида течения болезни.

1. Классическое трехэтапное течениеили буйная форма . Вначале отмечается изменение поведения животного (1 этап), оно становится очень ласковым или наоборот пугливым, необщительным. Этот этап может длиться от нескольких часов до 4 дней. Затем наступает следующий этап - возбуждения (2 этап), который продолжается 1-4 дня. Животные становятся агрессивными, склонны к блуждающим передвижениям и нападением на животных и людей. Развивается анорексия, беспокойство, слюнотечение. И за 3-4 дня до смерти развиваются паралитическая, или депрессивная, стадия, характеризующаяся прогрессирующими параличами.
2. Паралитическая, или тихая, форма. Характеризуется развитием параличей без предшествующей стадии возбуждения. При этой форме отмечают слюнотечение, отвисание нижней челюсти, затрудненное глотание, анорексию. Затем развивается паралич мышц туловища и конечностей. Смерть животного наступает через 3-4 дня.
3. «Атипичное бешенство». Это хроническое субклиническое (без развития симптомов) течение болезни, которое может длиться до 3 месяцев.

Диагноз .

Предварительный диагноз ставят на основании анамнеза и клинических симптомов. При подозрении на бешенство после смерти животного в лабораторию направляют труп животного. При невозможности этого – голову или головной мозг. При взятии материла необходимо соблюдать строгие меры предосторожности!
Лабораторная диагностика бешенства включает в себя несколько методов исследования.

1. Обнаружение телец Бабеша-Негри. Для постановки диагноза на бешенство в лаборатории проводят гистологическое исследование головного мозга умершего животного. Отмечают наличие рабических узелков в структурах дна четвертого желудочка мозга и наличие в головном мозге телец Бабеша-Негри (цитоплазматические эозинофильные включения, состоящий из частиц вируса бешенства). Их можно обнаружить в гипокампе, корковых и стволовых структурах мозга, в мозжечке и дорсальных ганглиях спинного мозга и эпителии роговицы глаза. Однако если тельца Бабеша-Негри не обнаруживаются, бешенство не исключается.
2. Выявление антигена методом флюоресцирующих антител (МФА) или методом иммунофлюоресцентного анализа (ИФА). Кроме этих реакций в настоящее время идет разработка нового метода диагностики в полимеразной цепной реакции (ПЦР).
3. Биологическая проба с заражением новорожденных мышат вирусом из взвеси головного мозга, слюнных желез.

Согласно законодательству РФ, в случаях покусов людей собаками или другими животными (кроме явно больных бешенством) пострадавшие должны немедленно обратиться в медицинские учреждения. А покусавшие их животные должны быть доставлены в ближайшее государственное ветеринарное учреждение для осмотра специалистами и карантина в течение 10 дней.

Для профилактики распространения бешенства предусмотрена ежегодная обязательная вакцинация собак и кошек антирабическими вакцинами.

В настоящее время для ввоза животных в ряд стран требуется документ подтверждающий количество валидных антител к вирусу бешенства. Для эффективной защиты от бешенства минимальный уровень вируснейтрализующих антител в крови должен составлять не менее 0,5 МЕ/мл. Данный вид исследования не является диагностическим и предназначен только для определения напряженности иммунитета против бешенства.
В Москве сдать кровь для определения титра антител к вирусу бешенства можно в Центре Молекулярной Диагностики, расположенном на Звенигородском шоссе, д.5. ЦДМ получил международную аккредитацию на проведение данного теста и выдает Международные сертификаты, действительные в течение всей жизни животного при соблюдении сроков ревакцинации.

Определение титров антител проводят не ранее чем через 30 дней после вакцинации. Поэтому если Вы планируете выезжать со своими питомцами в страны ЕС или другие страны, то необходимо заранее позаботиться о вакцинации и сдаче крови на этот тест (результаты выдаются через 7-14 дней).

Врач-лаборант ветеринарной лаборатории
«БиоВетЛаб» Лазарева Н.В.

Бешенство (Rabies) – инфекционное заболевание, опасное для животных и человека. Данное заболевание встречается во всех странах мира. Характеризуется 100% летальным исходом.

Возбудитель – РНК-содержащий вирус, относящийся к семейству Рабдовирусов. Данный вирус имеет тропность к нервной ткани. В наибольших титрах обнаруживается в головном мозге больных животных. Кроме того, находят вирусы и в спинном мозге, слюнных и слезных железах.
Различают:

1. «дикий» вирус, который циркулирует в естественных условиях и характеризуется высокой патогенностью для человека и животных.
2. И «фиксированный», полученный в лабораторных условиях, не патогенный для животных и человека при экстраневральном введении.

Вирус бешенства не устойчив к высоким температурам: при 60С о инактивируется через 10 минут, при 100С о - почти мгновенно. Но вот в замороженном мозге может сохранять жизнеспособность до нескольких месяцев. Также сохраняется несколько месяцев в гниющих тканях. Устойчив к действию растворов йода. Но быстро инактивируется дезрастворами на основе формалина, хлорамина и щелочи.

Эпизоотологические данные.

К вирусу бешенства восприимчивы все теплокровные. Наибольшей чувствительностью обладают дикие собачьи (такие как: лисицы, песцы, волки, енотовидная собака, шакалы), куньи, грызуны кошки. Менее восприимчивы птицы.

В дикой природе резервуарами вируса бешенства являются хищные животные и летучие мыши, в городе - бродячие собаки.
Источником заражения являются больные животные, у которых вирус выделяется со слюной. Наличие вируса в слюне отмечают уже за 8-10 дней до появления признаков болезни. Заражение происходит при укусе, при попадании слюны на слизистые оболочки или на поврежденные участки кожи.

Патогенез .

После проникновения в организм вирус начинает размножаться в месте внедрения. И через 24 часа начинает проникать в нервную ткань. В нервах он продвигается в направлении спинного и головного мозга со скоростью 7 см/день. Добравшись до мозга вирус начинает усиленно размножаться, затем по нервам вирус попадает во все органы и в первую очередь в слюнные железы и глаза. Инкубационный период (от момента заражения до появления клинических признаков) составляет в среднем 14 – 60 дней, иногда может достигать 6-12 месяцев.
Клинические признаки.

Различают 3 вида течения болезни.

1. Классическое трехэтапное течениеили буйная форма . Вначале отмечается изменение поведения животного (1 этап), оно становится очень ласковым или наоборот пугливым, необщительным. Этот этап может длиться от нескольких часов до 4 дней. Затем наступает следующий этап - возбуждения (2 этап), который продолжается 1-4 дня. Животные становятся агрессивными, склонны к блуждающим передвижениям и нападением на животных и людей. Развивается анорексия, беспокойство, слюнотечение. И за 3-4 дня до смерти развиваются паралитическая, или депрессивная, стадия, характеризующаяся прогрессирующими параличами.
2. Паралитическая, или тихая, форма. Характеризуется развитием параличей без предшествующей стадии возбуждения. При этой форме отмечают слюнотечение, отвисание нижней челюсти, затрудненное глотание, анорексию. Затем развивается паралич мышц туловища и конечностей. Смерть животного наступает через 3-4 дня.
3. «Атипичное бешенство». Это хроническое субклиническое (без развития симптомов) течение болезни, которое может длиться до 3 месяцев.

Диагноз .

Предварительный диагноз ставят на основании анамнеза и клинических симптомов. При подозрении на бешенство после смерти животного в лабораторию направляют труп животного. При невозможности этого – голову или головной мозг. При взятии материла необходимо соблюдать строгие меры предосторожности!
Лабораторная диагностика бешенства включает в себя несколько методов исследования.

1. Обнаружение телец Бабеша-Негри. Для постановки диагноза на бешенство в лаборатории проводят гистологическое исследование головного мозга умершего животного. Отмечают наличие рабических узелков в структурах дна четвертого желудочка мозга и наличие в головном мозге телец Бабеша-Негри (цитоплазматические эозинофильные включения, состоящий из частиц вируса бешенства). Их можно обнаружить в гипокампе, корковых и стволовых структурах мозга, в мозжечке и дорсальных ганглиях спинного мозга и эпителии роговицы глаза. Однако если тельца Бабеша-Негри не обнаруживаются, бешенство не исключается.
2. Выявление антигена методом флюоресцирующих антител (МФА) или методом иммунофлюоресцентного анализа (ИФА). Кроме этих реакций в настоящее время идет разработка нового метода диагностики в полимеразной цепной реакции (ПЦР).
3. Биологическая проба с заражением новорожденных мышат вирусом из взвеси головного мозга, слюнных желез.

Согласно законодательству РФ, в случаях покусов людей собаками или другими животными (кроме явно больных бешенством) пострадавшие должны немедленно обратиться в медицинские учреждения. А покусавшие их животные должны быть доставлены в ближайшее государственное ветеринарное учреждение для осмотра специалистами и карантина в течение 10 дней.

Для профилактики распространения бешенства предусмотрена ежегодная обязательная вакцинация собак и кошек антирабическими вакцинами.

В настоящее время для ввоза животных в ряд стран требуется документ подтверждающий количество валидных антител к вирусу бешенства. Для эффективной защиты от бешенства минимальный уровень вируснейтрализующих антител в крови должен составлять не менее 0,5 МЕ/мл. Данный вид исследования не является диагностическим и предназначен только для определения напряженности иммунитета против бешенства.
В Москве сдать кровь для определения титра антител к вирусу бешенства можно в Центре Молекулярной Диагностики, расположенном на Звенигородском шоссе, д.5. ЦДМ получил международную аккредитацию на проведение данного теста и выдает Международные сертификаты, действительные в течение всей жизни животного при соблюдении сроков ревакцинации.

Определение титров антител проводят не ранее чем через 30 дней после вакцинации. Поэтому если Вы планируете выезжать со своими питомцами в страны ЕС или другие страны, то необходимо заранее позаботиться о вакцинации и сдаче крови на этот тест (результаты выдаются через 7-14 дней).

Врач-лаборант ветеринарной лаборатории
«БиоВетЛаб» Лазарева Н.В.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ БЕШЕНСТВА

1. Диагноз на бешенство ставят на основании комплекса эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и главным образом - на основании лабораторных исследований.

2. Для исследования направляют в лабораторию с нарочным: свежий труп или голову от собаки (кошки, лисицы, песца, овцы, теленка и др.), от крупных животных - голову или головной мозг (свежий или консервированный в 30 - 50 %-ном растворе глицерина). Для серологических исследований пригоден только неконсервированный мозг.

3. Лабораторная диагностика бешенства заключается в микроскопическом исследовании головного мозга (с целью обнаружения телец Бабеша-Негри), серологическом (обнаружение специфического рабического антигена), а также в постановке биологической пробы на белых мышах или кроликах.

Порядок исследований.

4. Из головного мозга, поступившего для исследования, делают сначала засев на питательные среды. Часть мозга сразу же помещают в холодильник и сохраняют на случай необходимости повторного исследования. Из оставшейся части мозга берут материал для микроскопического исследования, серологических реакций и биологической пробы.

Примечание . Вскрытие трупа, изъятие мозга и другие работы проводят в стерильных условиях при строгом соблюдении мер личной профилактики (прочная фиксация головы животного, защита рук двумя парами перчаток: хирургическими и анатомическими; для защиты глаз надевают очки, а нос и рот закрывают марлевой повязкой).

I. МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

5. Для микроскопического исследования делают отпечатки и мазки из разных участков головного мозга.

6. Для приготовления отпечатка кусочки головного мозга (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг) кладут на фильтровальную бумагу, сложенную в 4 - 6 слоев. К поверхности среза несколько раз (3 - 4) подряд прикасаются чистым предметным стеклом, слегка надавливая, чтобы на стекле получился тонкий отпечаток.

7. Мазки делают из тех же участков головного мозга. Для этого кусочки мозга растирают в фарфоровой ступке пестиком или в пробирке стеклянной палочкой до образования гомогенной массы, из которой делают грубые мазки на обезжиренном предметном стекле.

Можно делать мазки и другим способом. Для этого небольшой кусочек мозга кладут на край предметного стекла, а другим стеклом раздавливают его и размазывают от одного края до другого, в результате чего на поверхности стекла получается тонкий равномерный мазок.

8. Полученные мазки или отпечатки окрашивают одним из следующих способов:

а) окраска по Муромцеву. Изготовленные, еще влажные мазки или отпечатки сразу же фиксируют в этиловом или метиловом спирте или в смеси спирта пополам с эфиром или ацетоном (химически чистым) в течение 1 - 2 ч и после этого промывают водой. Сосуд с фиксатором должен быть хорошо закрыт, чтобы предупредить испарение фиксирующей жидкости. После промывания водой влажные мазки помещают на 5 - 10 мин в раствор краски Мансона, разведенной водой 1:40. Затем краску сливают и тут же мазки погружают в 10 %-ный водный раствор танина на 8 - 10 мин до появления голубоватой окраски. После этого мазки промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой, проводят через смесь из равных частей спирта с ацетоном (химически чистым) или спирта с ксилолом й снова высушивают фильтровальной бумагой. Окрашенный мазок должен иметь светло-голубой фон, при этом ядра нервных клеток окрашиваются в синий цвет, а тельца Бабеша-Негри - в бледно-фиолетовый с темными включениями;

б) окраска по Селлерсу. На приготовленный влажный отпечаток или мазок наносят на 4 - с смесь реактива «А» (метиленовый синий - 2 г, метиловый спирт без ацетона - 100 мл) и реактива «Б» (основной фуксин - 0,5 г, этиловый спирт без следов ацетона - 100 мл). Рабочий раствор красителя состоит из 15 мл реактива «А», 2 - 4 мл реактива «Б» и 25 мл метилового спирта. После окраски препарат промывают проточной водой и высушивают. В окрашенном мазке цитоплазма нейронов ярко-синяя, ядрышки темно-синие, эритроциты кирпично-красные, тельца Бабеша-Негри пурпурно-красные с отчетливо видной базофильной структурой телец;

в) окраска по Михину. Мазки или отпечатки фиксируют в смеси спирта и эфира (поровну) в течение 5 - 10 мин, после чего их просушивают фильтровальной бумагой и окрашивают в течение 30 - 40 мин краской Гимза (1 - 2 капли на 1 мл дистиллированной воды), быстро промывают подкисленным спиртом (1 капля ледяной уксусной кислоты на 30 мл 96°-ного спирта), а затем водой, просушивают фильтровальной бумагой и подвергают исследованию. Если материал был в глицерине, то его предварительно хорошо прополаскивают в воде и просушивают фильтровальной бумагой.

В окрашенном препарате при микроскопическом исследовании основной фон должен быть красным с фиолетовым оттенком. При преобладании синего тона мазок снова обмывают подкисленным спиртом и промывают водой. Пирамидальные нервные клетки имеют синеватый цвет с интенсивно черным ядром, а тельца Бабеша-Негри - розово-красный с точечными включениями темно-синего цвета;

г) окраска по Борману-Гайнуллиной. Тонкие мазки или отпечатки в течение 5 мин фиксируют в смеси следующего состава: спирта и эфира (поровну) - 98 мл, ледяной уксусной кислоты - 2 мл; после фиксации их погружают на 5 мин в 10 % -ный раствор кристаллической соды, а затем промывают водой и просушивают на воздухе. Зафиксированные мазки в течение 2 мин окрашивают краской, приготовленной перед ее употреблением (насыщенного водного раствора метиленовой сини - 3 капли, насыщенного основного раствора фуксина - 2 капли, водопроводной воды - 20 мл). Раствор краски наливают на мазок, фиксируют над пламенем горелки, затем краску оставляют еще на одну минуту, после чего промывают водой и просушивают фильтровальной бумагой. В окрашенном мазке основной фон должен быть ярко-красным, протоплазма нервных клеток окрашивается в красновато-синий цвет, а их ядра - в темно-синий, тельца Бабеша-Негри окрашиваются в землянично-красный цвет с типично гранулярной структурой. Эритроциты имеют вид неокрашенных кружочков.

II. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

9. Реакция диффузной преципитации в агаровом геле. Реакция применяется для обнаружения специфического рабического антигена в неконсервированном головном мозге животных, павших от уличного бешенства, а также у животных, на которых ставилась биопроба. Для реакции можно использовать несвежий (до 1 мес.) головной мозг.

Реакцию выполняют на предметных обезжиренных стеклах, на которые наносят 2,5 мл расплавленного и охлажденного до 60 °С агарового геля, приготовленного по прописи: сухой агар-агар - 12 - 15 г; химически чистый хлористый натрий - 8,6 г; 1 %-ный раствор (фильтрованный) метилоранжа на 50°-ном спирте - 5 - 10 мл; мертиолят - 0,01 г; вода дистиллированная - 1 л.

Примечание . Для постановки реакции лучше употреблять агар-агар фирмы «Дифко», он полностью растворяется, фильтрование среды не требуется. Другие сорта агар-агара требуют тщательной фильтрации.

После застывания агара в нем делают лунки с помощью тонкостенной металлической или стеклянной трубочки с внутренним диаметром 4 - 5 мм, располагая их согласно трафарету (см. рис. - ).

Для реакции у крупных животных используют кусочки головного мозга - аммонов рог, кору полушарий, мозжечок, продолговатый мозг; у крыс, сусликов, морских свинок, хомяков и др. - три каких-либо отдела мозга; у мышей - весь головной мозг.

Схема постановки микропреципитации:
А - кора (левое полушарие); В - кора (правое полушарие); С - аммонов рог (левый);
Д - аммонов рог (правый); Е - мозжечок; Ж - продолговатый мозг;
1 , 2 , 3 , 4 - разведений глобулина, соответственно 1:2, 1:4, 1:8, 1:16.

Положительная РП со всеми разведениями глобулина
(кора головного мозга овцы, уличное бешенство)

Положительная РП с разведениями глобулина 1:4; 1:8, 1:16
(аммонов рог собаки, уличное бешенство)

Положительная РП с разведениями глобулина 1:16,
отсутствуют линии преципитации с разведениями 1:2, 1:4,
(продолговатый мозг собаки, уличное бешенство)

Мозг растирают в фарфоровой ступке пестиком или в самой черепной коробке в «пасту», которой заполняют луночки для антигена. Остальные луночки заполняют преципитирующим антирабическим глобулином в разведении 1:2, 1:4, 1:8, 1:16. Объем используемых ингредиентов составляет 0,02 мл.

Контроли с положительными и отрицательными антигенами ставят одновременно на отдельном стекле с использованием того же агара по тому же трафарету.

После того как ингредиенты реакции помещены в соответствующие луночки, предметные стекла переносят во влажную камеру (чашки Петри с влажной фильтровальной бумагой или ватой) и ставят в термостат на 6 ч при температуре 37 - 38 °С. Затем чашки оставляют при комнатной температуре еще на 18 ч.

Учет реакции проводят через 3, 6 и 24 ч после ее постановки. Во избежание высыхания агара стекла с реакцией после каждого просмотра помещают в те же чашки Петри, содержащие увлажненную вату.

При положительной реакции преципитации в агаре между лунками с глобулином и антигеном могут образовываться одна, две и очень редко три параллельно расположенные линии преципитации. Образовавшиеся линии преципитации видимы визуально при просвечивании стекол осветителем снизу вверх под углом приблизительно 45°.

При отрицательных показаниях реакции преципитации ставят биопробу.

10. Реакция иммунофлуоресценции. Основана на выявлении специальными микроскопами (МЛ-1, МЛ-2, МЛ-3 и др.) вирусного антигена, вступившего в реакцию со специфической антирабической сывороткой, меченной флуоресцирующим красителем.

Для реакции делают тонкие и равнослойные отпечатки на тщательно обезжиренных стеклах из свежего или свежемороженого головного мозга. Отпечатки готовят из кусочков головного мозга (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг) так же, как и для микроскопического исследования. От каждого кусочка мозга готовят не менее 4 препаратов. Для контроля аналогично делают препараты из мозга здорового животного.

После высушивания на воздухе препараты фиксируют в ацетоне в течение 4 ч при температуре не выше 4 °С. Сосуд с фиксатором должен быть хорошо закрыт, чтобы предупредить испарение фиксирующей жидкости. После фиксации ацетоном наносят на препараты несколько капель конъюгата (флуоресцирующий антирабический гамма-глобулин) в рабочем разведении. Затем их помещают во влажную камеру (чашку Петри или закрытый эмалированный кювет с увлажненным дном) на 20 - 30 мин при температуре 25 °С.

После этого препараты промывают водой или фосфатным буферным раствором (pH 7,2 - 7,4) в течение 1 ч, затем ополаскивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и подвергают исследованию. Препараты просматривают под иммерсионной системой. Для иммерсии используют нелюминесцирующее масло.

В окрашенном препарате при люминесцентной микроскопии мозговая ткань флуоресцирует (светится) тусклым серовато-желтым цветом. Антиген вируса бешенства выявляется в препаратах в виде ярких желтовато-зеленых или зеленых гранул различной формы и величины - от едва заметных до имеющих 15 - 20 мкм в диаметре.

В контрольном препарате желто-зеленых интенсивно светящихся гранул не отмечается.

При исследовании с помощью метода флуоресцирующих антител диагноз бешенства считается установленным, если в нескольких полях зрения микроскопа обнаруживают достаточное количество (не менее 10) типичных гранул с ярким зеленоватым свечением различной величины. В контроле подобных образований не должно быть.

При отсутствии положительной флуоресценции ставят биологическую пробу.

III. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ПРОБА

11. Биологическую пробу на бешенство ставят, если получен отрицательный результат при микроскопическом исследовании (тельца Бабеша-Негри не обнаружены), при серологических реакциях (специфический рабический антиген не выявлен), а также при выявлении атипичных включений. Биологическую пробу проводят на белых мышах или кроликах.

12. Опытных мышей или кроликов заражают 10 %-ной суспензией из исследуемого мозга на физиологическом растворе или мясопептонном бульоне с pH 7,2 - 7,4. Для приготовления суспензии используются те же участки головного мозга, из которых брали материал для микроскопического и серологического исследований.

Вырезанные участки головного мозга собирают в стерильную пробирку и взвешивают, а затем тщательно растирают в ступке пестиком, после чего добавляют физиологический раствор или мясопептонный бульон из расчета получения 10 %-ной суспензии. Полученную суспензию отстаивают в течение 10 мин и для заражения используют надосадочную жидкость.

Если патологический материал был загрязнен, то надосадочную жидкость сливают в другой сосуд (пробирку) и к ней добавляют по 500 - 1000 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл жидкости, после чего отстаивают еще 30 мин при комнатной температуре и затем используют для заражения. Суспензию необходимо готовить в стерильных условиях и при строгом выполнении правил личной профилактики.

Биологическая проба на белых мышах . Для заражения используют белых мышей массой 8 - 10 г. Для каждого исследования берут 6 мышей, из которых 3 заражают в головной мозг, а 3 - подкожно. При заражении в мозг иглу вводят в точке за линией, соединяющей задние углы и немного в стороне от линии, проходящей посередине головы. Место заражения протирают спиртом. Суспензию вводят в дозе 0,03 мл. Для предупреждения глубокого проникновения иглы в мозг на ее кончик надевают ограничитель - небольшой кусочек резиновой трубки, который укрепляют на расстоянии 2 - 3 мм от конца иглы. При подкожном заражении суспензию вводят в область кончика носа (в верхнюю губу) в дозе 0,05 мл. На месте введения суспензии образуется небольшая припухлость. Зараженных мышей помещают в стеклянные банки и наблюдают за ними в течение 30 сут. При положительном результате биологической пробы у мышей обычно на 7 - 15-й день после заражения развивается клиника паралитического бешенства.

Вначале отмечаются вялость, взъерошенность шерсти и своеобразная горбатость, а также нарушение координации движений. Затем наступает паралич задних конечностей, а позднее - передних, переходящих в общий паралич, заканчивающийся смертью. Продолжительность болезни 2 - 3 сут.

С развитием общего паралича мышей умерщвляют при помощи эфирного или хлороформенного наркоза. У павших и убитых мышей вскрывают черепную полость, делают засев из мозга на питательные среды, после чего извлекают головной мозг, из которого готовят препараты для микроскопического и иммунобиологических исследований.

При отсутствии клинических проявлений бешенства у зараженных мышей в течение 30 сут их уничтожают. Банки, в которых они содержались, тщательно дезинфицируют.

Биологическая проба на кроликах . Для постановки биологической пробы берут 4 кроликов массой не менее 1,5 кг каждый. 2 кроликов заражают в мозг и 2 внутримышечно в области бедра. Суспензию вводят интрацеребрально в дозе 0,2 мл, а внутримышечно - в дозе 2 мл.

При положительном результате биологической пробы кролики заболевают в течение 16 - 21 дня. Заболевание бешенством протекает у кроликов в тихой паралитической форме со смертельным исходом. У павших кроликов извлекают головной мозг и дальнейшее исследование проводят так же, как и при заражении мышей. Наблюдение за кроликами ведут в течение 45 - 50 сут. По истечении указанного срока кроликов уничтожают. Клетки, в которых содержались подопытные животные, дезинфицируют.

IV. ГИСТОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ 1

1 Гистологическое исследование используют в качестве дополнительного метода

Для гистологического исследования берут кусочки аммонова рога, коры полушарий, мозжечка, продолговатого мозга и фиксируют в одной или двух порциях ацетона так, чтобы продолжительность фиксации была в пределах 6 - 18 ч.

Лучше фиксацию в ацетоне оставлять на ночь. Затем патматериал проводят через две порции ксилола, выдерживая по 30 мин в каждой, и через две порции парафина - по 1 ч в каждой. Готовые срезы депарафинируют обычным методом и окрашивают по Ленцу или Туревичу:

Окраска по Ленцу. Срезы окрашивают раствором эозина 1 - 3 мин (0,5 г эозина растворяют в 100 мл 60°-ного этилового спирта). Эозин быстро смывают водой и в течение 1 мин окрашивают метиленовой синькой Лефлера, промывают водой, осторожно подсушивают фильтровальной бумагой и дифференцируют раствором ед. кого натра в абсолютном спирте (5 капель едкого натра на 30 мл спирта) до бледно-розового цвета. На препарат наливают раствор уксусной кислоты (1 капля ледяной уксусной кислоты на 60 мл абсолютного спирта) и держат до появления слабо-синей окраски, быстро смывают спиртом и просветляют ксилолом в течение 4 - 5 мин. Тельца Бабеша-Негри окрашиваются в ярко-красный цвет с синими включениями, цитоплазма ганглиозных клеток - в бледно-голубой;

Окраска по Туревичу. Депарафинированные срезы сразу после проводки через спирты и дистиллированную воду окрашивают гематоксилином Вейгерта или Эрлиха, промывают дистиллированной водой. Затем окрашивают 1 %-ным водным раствором кислого фуксина в течение 1 мин и тщательно промывают дистиллированной водой до появления бледно-розового оттенка. После промывки обрабатывают смесью (в равных частях) насыщенного водного раствора пикриновой кислоты (на 1 л горячей дистиллированной воды 25 - 30 г пикриновой кислоты) и 96°-ного спирта. При обработке наблюдают отхождение облачков красной краски, и срезы через 10 - 20 с приобретают желтый оттенок. Срезы быстро прополаскивают в воде и слегка обсушивают фильтровальной бумагой. Затем так же быстро проводят через абсолютный или 96°-ный спирт, карбол-ксилол, чистый ксилол и заключают в бальзам. Тельца Бабеша-Негри - вишнево-красного цвета, ядра клеток - черные или синие в зависимости от того, каким гематоксилином они окрашены. По форме и величине тельца Бабеша-Негри весьма разнообразны, находятся в цитоплазме и отростках нервных клеток в виде многочисленных или одиночных экземпляров. Чаще тельца Бабеша-Негри обнаруживают в крупных ганглиозных клетках, причем клетки, содержащие их, не имеют выраженных признаков дегенерации.

Нередко обнаруживают другие включения, которые из-за ряда сходных признаков иногда принимают за тельца Негри. Следует иметь в виду, что в мозге здоровых кошек и белых мышей иногда содержатся неспецифические ацидофильные тельца-включения. Эти тельца можно отдифференцировать от телец Негри по отсутствию внутренних гранул и гомогенности основной субстанции.

Для бешенства также характерны признаки острого энцефаломиелита: преимущественно вокруг мелких вен обнаруживают периваскулярные инфильтраты, состоящие в основном из лимфоидных клеток, имеющих вид клеточных муфт.

В ганглиозных клетках головного мозга могут быть хроматолиз, вакуолизация и острое набухание клеток, а также гибель отдельных клеток. В области поврежденных нервных клеток довольно постоянна пролиферативная реакция глии, принимающая форму истинной нейронофагии с последующим замещением нервных клеток элементами размножившейся глии. Такое скопление клеток пролиферата на месте распавшейся нервной клетки носит название «узелка бешенства» - на срезе иногда можно проследить процесс развития узелка (1).

Бешенство - острая инфекционная болезнь, протекающая с тяжелым поражением нервной системы, как правило, с леталь­ным исходом. Восприимчивы человек и все млекопитающие жи­вотные.

Бешенство распространено повсеместно. Возбудителя инфек­ции передают собаки, кошки, дикие грызуны и хищники, а также кровососущие летучие мыши-вампиры.

Продолжительность инкубационного периода зависит от ме­ста и силы укуса, количества и вирулентности попавшего в рану вируса, резистентности покусанного животного. Инкубационный период длится от 1-3 нед до года и даже более.

Болезнь протекает остро. Клинические признаки ее в основ­ном одинаковы у всех животных, но наиболее типичны они у со­бак, у которых может наблюдаться как буйное, так и тихое (па­ралитическое) течение болезни. У крупного рогатого скота бе­шенство может протекать атипично (потеря аппетита, атония рубца, паралич глотки, слюнотечение). Стадии возбуждения мо­жет не быть.

Патологоанатомические изменения неспецифичны. У мясоедных (в основном у собак) в желудке можно обнаружить инородные предметы.

Вирус бешенства обладает выраженной нейропробазией. Про­никая с периферии (место укуса) по нервным стволам в централь­ную нервную систему центростремительно, он распространяется в организме центробежно по периферическим нервам и попадает в разные органы, включая слюнные железы.

Вирус относится к семейству Rhabdoviridae, родуLyssavirus . Вирионы имеют форму стержня с обрубленным концом. Вирион виру­са - РНК-содержащий со спиральным типом симметрии, имеет липопротеидную оболочку. Низкие температуры консервируют вирус. Температура 60 °С убивает его через 5-10 мин, солнечный свет - за 5-7 дней. Растворы формалина, фенола, соляной кислоты (5%-ные) инактивируют вирус за 5-10 мин.

Вирион вируса бешенства содержит гликопротеидный (наруж­ный) и нуклеокапсидный (внутренний) антигены. Гликопротеидный антиген индуцирует образование вируснейтрализующих анти­тел, а нуклеокапсидный - комплементсвязывающих и преципитирующих антител.

В организме вирус локализуется главным образом в централь­ной нервной системе, а также в слюнных железах и слюне.

Культи­вируется на мышах, кроликах, морских свинках и других живот­ных, а также в первичных культурах клеток (почки хомячка, эмбриона овец, телят и др.) и перевиваемых клетках. Размножение вируса в культурах клеток не всегда проявляется ЦПД. К вирусу бешенства после предваритель­ной адаптации восприимчивы и куриные эмбрионы. Вирус индуци­рует образование цитоплазматических телец-включений, которые чаще всего обнаруживают в клетках аммонова рога, мозжечка, коры головного мозга.

Источником инфекции являются больные животные. Они переда­ют вирус во время укуса. Плотоядные животные могут заражаться при поедании головного и спинного мозга погибших от бешенства животных. Доказана возможность заражения бешенством аэрогенным путем (в местах, где имеются летучие мыши). До 60-х годов основ­ным источником распространения бешенства были собаки и кошки, позднее лисицы, волки, корсаки и другие дикие животные.

Диагноз на бешенство ставят на основании эпизоотологических, клинических данных и результатов лабораторных исследований, име­ющих решающее значение.

При работе с больными животными и инфекционным мате­риалом необходимо строго соблюдать меры личной безопаснос­ти: надевать резиновые перчатки, халаты с нарукавниками, ре­зиновый или полиэтиленовый фартук, резиновые сапоги, защит­ные очки, защитную маску на лицо.

Вскрывать подозрительных на заболевание бешенством жи­вотных в полевых условиях запрещено.

Получение пат.материала . Для исследования на бешенство направляют в лабораторию свежие трупы мелких животных целиком, а от крупных и средних животных - голову с двумя первыми шейными позвонками. Трупы мелких животных перед отправкой на исследование обрабатывают инсектици­дами.

Патологический материал упаковывают в пластмассовые меш­ки, вкладывают в плотно закрывающиеся ящики с влагопоглощающей прокладкой, пропитанной дезинфектантом. Материал и сопроводительное письмо, в котором указаны отправитель и его адрес, вид животного, анамнестические данные и обоснование подозрений в заболевании животного бешенством, дата и подпись врача.

Лабораторная диагностика . Она включает: обнаружение вирус­ного антигена в РИФ и РДП, телец Бабеша-Негри и биопробы на белых мышах.

РИФ. Для данной реакции биопромышленность выпускает флуо­ресцирующий антирабический гамма-глобулин.

Методика постановки РИФ . На обезжиренных предметных стек­лах готовят тонкие отпечатки или мазки из различных отделов голов­ного мозга левой и правой стороны (аммонов рог, кора полушарий, мозжечок, продолговатый мозг). Готовят не менее двух препаратов каждого отдела мозга. Можно также исследовать спинной мозг, подчелюстные, слюнные железы. Для контроля делают препараты из мозга здорового животного (обычно белой мыши).

Препараты высушивают на воздухе, фиксируют в охлажденном ацетоне (минус 20 °С от 4 до 12 ч), высушивают на воз­духе наносят Флуоресцирующий гамма-глобулин, помещают во влаж­ную камеру при 37 °С на 25-30 мин, затем тщательно промывают физиологическим раствором или фосфатным буфером с рН 7,4, спо­ласкивают дистиллированной водой, высушивают на воздухе, нано­сят нефлуоресцирующее иммерсионное масло и просматривают под люминесцентным микроскопом.

В препаратах, содержащих антиген вируса бешенства наблюдаются разной величины и формы флуорес­цирующий желто-зеленым цветом гранулы в нейронах , но чаще вне клеток.

В контроле подобного свечения не должно быть , нервная ткань обычно светится тусклым сероватым или зеленоватым цветом. Интенсивность свечения оценивают в крестах.

Отрицатель­ным считают результат при отсутствии специфической флуоресцен­ции.

Материал от животных, вакцинированных против бешенства, нельзя исследовать в РИФ в течение 3 мес. после прививки, так как может быть флуоресценция антигена вакцинного вируса.

В РИФ не подлежат исследованию ткани, консервированные глицерином, формалином, спиртом и

т. д., а также материал, име­ющий признаки даже незначительного загнивания.

РДП в агаровом геле . Метод основан на свойстве ан­тител и антигенов диффундировать в агаровом геле и при встрече образовывать видимые визуально линии преципитации (комплекс антиген +антитело). Применяют для обнаружения антигена в мозге животных, павших от уличного вируса бешенства, или при экспери­ментальной инфекции (биопроба).