1. Витамин В 1 (тиамин)
а) с диазореактивом
Принцип метода. Сначала образуется диазобензолсульфат (диазобензолсульфокислота):
Раствор тиамина при добавлении диазобензолсульфата и щелочи дает окрашенное соединение.
Ход работы. В пробирку последовательно добавляют:
б) окисления в тиохром
Принцип метода. При действии K 3 Fe(CN) 6 в щелочной среде тиамин окисляется в желтый тиохром, обладающий голубой флуоресценцией в УФ-свете.
Ход работы. 10 мг порошка тиаминбромида или тиаминхлорида растворяют в 5 мл воды, прибавляют 1мл 5%-го раствора железосинеродистого калия K 3 Fe(CN) 6 (феррицианид калия) и 1 мл 10%-го раствора едкого натра, и перемешивают. Половину получившегося объема нагревают и наблюдают окрашивание в желтый цвет в результате превращения тиамина в тиохром. К другой половине добавляют 3 мл бутилового или изоамилового спирта, хорошо встряхивают и оставляют на несколько минут. Верхний, спиртовой слой дозатором отбирают в емкость из нефлуоресцирующего стекла и рассматривают в УФ-свете (можно – в лучах ртутно-кварцевой лампы в темном посещении). Хорошо заметна голубая флуоресценция.
в) снять спектр поглощения (модуль “спектральный”, диапазон от 350 до 220нм) и наблюдать максимум при λ=250-260 нм. График сохранить, перевести в Paint, затем вставить в файл “Графики” (документ Word), подписать и вклеить в отчет. ВНИМАНИЕ! Спектры всех витаминов сниматьодновременно
, чтобы включать и прогревать спектрофотометр только один раз. 
УФ-спектр тиамина гидрохлорида (8 мкг/мл) в растворе HCl 0,9%. Максимум при 246 нм.
2. Витамин В 2 (рибофлавин)
а) с металлическим цинком
Принцип метода. Рибофлавин восстанавливается выделяющимся водородом в бесцветный лейкофлавин. Наблюдается изменение окраски из желтой в зеленоватую, позже в малиновую, розовую, а затем – цвет исчезает.
Ход работы. В пробирку наливают 1мл взвеси рибофлавина в воде (0,015 - 0,025% раствор), добавляют 10 капель концентрированной HCl и опускают кусочек металическо-го цинка. Начинается бурное выделение пузырьков водорода, и жидкость постепенно окрашивается в розовый или красный цвет, затем окраска жидкости начинает бледнеть и обесцвечиваться (обратное окисление лейкофлавина в рибофлавин).
б) с азотнокислым серебром
Принцип метода. Нейтральные или слабокислые растворы рибофлавина (рН 6,5-7,2), реагируя с AgNO 3 , дают соединение розово-красных тонов. Интенсивность окраски зависит от концентрации витамина.
Ход работы. К 1 мл р-ра рибофлавина (0,015 - 0,025%) добавляют 0,5 мл р-ра AgNO 3 (0,1%). Появляется розовое окрашивание.
в) флуоресценция в УФ + ее тушение после добавления SnCl 2 +Na 2 S 2 O 4 , которые тушат флуоресценцию самого витамина, но не примесей. Флуоресценция рибофлавина максимальна при рН 3,5-7,5. Снять спектр в растворе ацетата натрия.
УФ-спектр рибофлавина (35 мкг/мл) в растворе ацетата натрия CH 3 COONa
0,01%. Максимум при 266,5 нм. Дополнительные пики при 223,0 нм, 373,5 нм и 444,5 нм.
3. Витамин В 5 (РР, никотиновая кислота)
а) с ацетатом меди
Принцип метода. При нагревании никотиновой кислоты с уксуснокислой медью образуется осадок медной соли никотиновой кислоты.
Ход работы. 5-10 мг никотиновой кислоты растворяют при нагревании в 10-20 каплях 10%-го раствора уксусной кислоты (или готовят 0,75% р-р никотиновой кислоты в горячей воде, а затем к 2 мл этого р-ра добавляют 1 мл 15%-ного р-ра уксусной к-ты). К нагретому до начала кипения раствору добавить равный объем 5%-го раствора уксуснокислой меди. Жидкость становится голубоватой мутной, а при стоянии и охлаждении выпадает осадок никотината меди синего цвета.
б) на запах пиридина
Принцип метода. При нагревании никотиновой кислоты с безводным Na 2 CO 3 ощущается неприятный запах пиридина.
Ход работы. В небольшом сухом фарфоровом тигле смешивают 0,05 г никотиновой к-ты с 0,1-0,15 г безводного углекислого натрия и подогревают. Появляется резкий запах пиридина.
4. Витамин В 6 (пиридоксин)
а) с хлорным железом
Принцип метода. Витамин В 6 образует с хлорным железом комплекс кроваво-красного цвета.
Ход работы. 4 мл 0,5-1% р-ра пиридоксина + 0,5мл 1%-ного FeCl 3 → встряхнуть и наблюдать красный цвет.
б) ДОПОЛНИТЕЛЬНО –
в) снять спектр в 0,1М NaOH (наблюдать максимумы при λ=245 и 308 нм) или воде (см.рис).
УФ-спектр пиридоксина гидрохлорида (15мкг/мл) в воде (рН≈6,0). Максимум при 291 нм.
5. Витамин В 12 – оформить в отчете, на практике не делаем в связи с высокой токсичностью действующего реактива.
Витамин В 12 реагирует с цианидом при рН=10 с образованием пурпурного дицианкобаламина, так как Со окисляется до 3х-валентного и 5’-дезоксиаденозин замещается на анион CN.
6. Витамин Р (на примере рутина)
К веществам Р-витаминного действия относится ряд соединений фенольной природы, основное физиологическое действие которых – уменьшение проницаемости и повышение прочности капилляров. Они способствуют усвояемости вит.С в организме человека и животных, активно участвуют в окислительно-восстановительных процессах, обладают антиокислительными свойствами, залерживая, среди прочего, и окисление адреналина. Они также инактивируют фермент гиалуронидазу, тем самым тормозя распад гиалуроновой кислоты – гетерополисахарида в основном веществе соединительных тканей. Вит. Р угнетают активность холинэстеразы, сукцинатдегидрогеназы и ряда других ферментов.
Витаминными свойствами обладает ряд флавонолов (рутин, кверцетин), флаванонов, катехинов, кумаринов, галловая кислота и ее производные, антоцианы (красящие вещества из плодов, ягод, цветков).
Многие вещества Р-витаминного действия – это гликозиды флавонолов и флаванонов или агликоны (неуглеводные компоненты гликозидов). Например, рутин – это гликозид, в котором к дисахариду рутинозе присоединен агликон фенольного строения флавонол кверцетин.
а) с хлорным железом
б) с серной кислотой
Принцип: Конц серная к-та образует с флавонами (рутином) оксониевые соли, обладающие в растворе желтой окраской. Флаваноны (например, гесперидин) дают с серной к-той малиновое окрашивание.
7. Витамин С
а) качественно - с K 3 Fe(CN) 6
Принцип метода: восстановление феррицианида калия витамином С с изменением окраски до синей из-за образования берлинской лазури.
Ход работы. В двух пробирках смешивают 5 капель 5%-го раствора К 3 Fe(CN) 6 c 5 каплями 1%-го раствора FeCl 3 . В одну из пробирок к зеленовато-бурой жидкости прибавляют 20 капель 1%-го раствора аскорбиновой кислоты или сока капусты, а в другую - столько же дистиллированной воды. Жидкость в первой пробирке приобретает зеленовато-синюю окраску, выпадает синий осадок берлинской лазури; во второй пробирке (контроль) зеленовато-бурая окраска жидкости остается без изменения.
Введение……………………………………………………………2
1. Общий обзор методов определения витаминов…………………3
2. Хроматографические методы определения витаминов…………5
3. Электрохимические методы определения витаминов…………10
4. Инверсионно вольтамперометрический метод определения
водорасторимых витаминов B 1 B 2 в пищевых продуктах………..13
Заключение………………………………………………………...18
Введение
В настоящее время на рынке появилось огромное количество витаминизированных продуктов питания для человека и кормов для животных, представляющих собой сухие многокомпонентные смеси. Ассортимент таких продуктов представлен достаточно широко. Это, прежде всего, биологически активные добавки к пище, премиксы, комбикорма для животных и птиц, поливитаминные препараты. Критерием качества таких продуктов может являться их анализ на содержание витаминов и, особенно, таких жизненно необходимых, как водорастворимые и жирорастворимые витамины, количество которых регламентируется нормативными документами и санитарными нормами качества.
Для определения витаминов применяют различные методы. Широко используемые оптические методы анализа трудоемки, требуют больших затрат времени и дорогостоящих реактивов, применение хроматографических методов осложнено использованием дорогостоящего оборудования. С каждым годом расширяется ассортимент и увеличивается производство продуктов питания, совершенствуется рецептура детского питания. Это в свою очередь предъявляет повышенные требования к контролю за качеством выпускаемой продукции и совершенствованию методов определения витаминов. Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов характеризуют пищевую ценность большинства видов и групп продуктов детского питания различного назначения.
1. Общий обзор методов определения витаминов
Почти все витамины легко подвергаются окислению, изомеризации и разрушаются под воздействием высокой температуры, света, кислорода воздуха, влаги и других факторов.
Из существующих методов определения витамина С (аскорбиновой кислоты) наиболее широко применяют метод визуального и потенциометрического титрования раствором 2,6-ди-хлорфенолиндофенола по ГОСТ 24556-81, основанный на редуцирующих свойствах аскорбиновой кислоты и ее способности восстанавливать 2,6-ДХФИФ. Темно-синяя окраска этого индикатора при добавлении аскорбиновой кислоты переходит в бесцветную. Важное значение имеет приготовление экстракта исследуемого продукта. Наилучшим экстрагентом является 6 %-ный раствор метафосфорной кислоты, который инактивирует аскорбинотоксидазу и осаждает белки.
Каротин в растительном сырье, концентратах и безалкогольных напитках контролируют физико-химическим методом по ГОСТ 8756.22-80. Метод основан на фотометрическом определении массовой доли каротина в растворе, полученном в процессе экстрагирования из продуктов органическим растворителем. Предварительно раствор очищают от сопутствующих красящих веществ с помощью колоночной хроматографии. Каротин легко растворяется в органических растворителях (эфир, бензин и др.) и придает им желтую окраску. Для количественного определения каротина используют адсорбционную хроматографию на колонках с окисью алюминия и магния. Такое определение пигментов на колонке зависит от активности адсорбента, количества пигментов, а также присутствия других компонентов в разделяемой смеси. Сухая смесь окиси алюминия задерживает каротин, а влажная пропускает в раствор другие красящие вещества.
Тиамин в основном находится в связанном состоянии в виде дифосфорного эфира - кокарбоксилазы, которая является активной группой ряда ферментов. С помощью кислотного гидролиза и под воздействием ферментов тиамин освобождается из связанного состояния. Этим способом определяют количество тиамина. Для расчета содержания витамина B1 используют флюрометрический метод, который применяют для определения тиамина в пищевых продуктах. Он основан на способности тиамина образовывать в щелочной среде с феррнцианндом калня тиохром, который дает интенсивную флюоресценцию в бутиловом спирте. Интенсивность процесса контролируют на флюорометре ЭФ-ЗМ.
В продуктах питания и напитках рибофлавин присутствует в связанном состоянии, т. е. в форме фосфорных эфиров, связанных с белком. Чтобы определить количество рибофлавина в продуктах, необходимо освободить его из связанного состояния путем кислотного гидролиза и обработки ферментными препаратами. Витамин B1 в безалкогольных напитках рассчитывают с помощью химического метода для определения количества легкогидролизуемых и прочно связанных форм рибофлавина в тканях. Метод основан на способности рибофлавина к флюоресценции до и после восстановления его гипосульфитом натрия. Определение общего содержания фенольных соединений. Для этого используют колориметрический метод Фолина - Дениса, который основан на образовании голубых комплексов при восстановлении вольфрамовой кислоты под действием полифенолов с реагентом в щелочной среде. Фенольные соединения определяют по хлорогеновой кислоте методом пламенной фотометрии на приборе ЕКФ-2.
2. Хроматографические методы определения витаминов
В последнее время за рубежом бурное развитие переживает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Это связано, прежде всего, с появлением прецизионных жидкостных хроматографов, совершенствованием техники выполнения анализа. Широкое использование метода ВЭЖХ при определении витаминов нашло отражение и в числе публикаций. На сегодняшний день более половины всех опубликованных работ по анализу как водо- так и жирорастворимых витаминов посвящено применению этого метода.Широкое распространение при определении витаминов получили различные варианты хроматографии.
Для очистки токоферола от посторонних примесей используют метод тонкослойной хроматографии В сочетании со спектрофотометрическими и флуориметрическими методами этим способом проводят и количественное определение витамина Е. При разделении используют пластинки с силуфолом, кизельгелем
Анализ изомеров токоферола в оливковом масле проводится методом газо-жидкостной хроматографии. Методики анализа ГХ и ГЖХ требуют получения летучих производных, что крайне затруднительно при анализе жирорастворимых витаминов. По этой причине данные способы определения не получили большого распространения. Определение витамина Е в пищевых продуктах, фармпрепаратах и биологических объектах проводят в градиентном и изократическом режимах как в нормально-фазовых, так и в обращенно-фазовых условиях. В качестве адсорбентов используют силикагель (СГ), кизельгур, силасорб, ODS-Гиперсил и другие носители. Для непрерывного контроля состава элюата в жидкостной хроматографии при анализе витаминов и увеличения чувствительности определения используют УФ (А,=292 нм), спектрофотометрический (Х=295нм), флуоресцентный (Х,=280/325нм), электрохимический, ПМР- и масс-спектроскопический детекторы.
Большинство исследователей для разделения смесей всех восьми изомеров токоферолов и их ацетатов предпочитают использовать адсорбционную хроматографию. В этих случаях подвижной фазой обычно служат углеводороды, содержащие незначительные количества какого-либо простого эфира. Перечисленные методики определения витамина Е, как правило, не предусматривают предварительного омыления образцов, что существенно сокращает время выполнения анализа.
Разделение с одновременным количественным определением содержания жирорастворимых витаминов (А, Д, Е, К) при их совместном присутствии в поливитаминных препаратах проводят как на прямой, так и на обращенной фазах. При этом большинство исследователей предпочитают использовать обращенно-фазовый вариант ВЭЖХ. Метод ВЭЖХ позволяет анализировать водорастворимые витамины В1 и В2 как одновременно, так и отдельно. Для разделения витаминов используют обращенно-фазный, ион-парный и ионообменный варианты ВЭЖХ. Применяют как изократический, так и градиентный режимы хроматографирования. Предварительное отделение определяемых веществ от матрицы осуществляют путем ферментативного и кислотного гидролиза пробы.
Преимущества метода жидкостной хроматографии:
Одновременное определение нескольких компонентов
Устранение влияния мешающих компонентов
Комплекс можно быстро перестроить на выполнение других анализов.
Состав и характеристика оборудования и программного обеспечения для жидкостного хроматографа "Хромос ЖХ-301":
Таблица 1
|
Достоинства хроматографа "Хромос ЖХ-301":
Высокая стабильность и точность поддержания расхода элюента обеспечивается конструкцией насосов высокого давления.
Легкий доступ к колонкам обеспечивается конструкцией прибора.
Эффективность разделения обеспечивается применением высокоэффективных хроматографических колонок.
Широкий линейный диапазон измерительного сигнала детекторов без переключений предела измерения, что позволяет с высокой точностью измерять пики как большой, так и малой концентрации.
Хроматограмма анализа водорастворимых витаминов:
1
аскорбиновая кислота (C),
2 никотиновая
кислота (Niacin),
3 пиридоксин (B6),
4 тиамин
(B1),
5 никотинамид (B3),
6 фолиевая
кислота (M),
7 цианокобаламин (B12),
8
рибофлавин (B2).
Хроматограмма анализа жирорастворимых витаминов:
1. Витамин А
2. токол
3. y -токоферол
4. a -токоферол (Витамин E)
5. лютеин
6.
зеаксантин
7. криптоксантин
8. a -каротин
Несмотря на высокую чувствительность метода ВЭЖХ, высокая стоимость приборов, а также длительность анализа с учетом времени пробоподготовки существенно ограничивает его применение в аналитических лабораториях нашей страны.
Количественное определение аскорбиновой кислоты в исследуемом материале часто осуществляют с помощью раствора 2,6-дихлофенолиндофенола натрия, который в щелочной среде имеет синюю окраску, в кислой – розовую. Химизм реакции можно выразить в виде следующего уравнения.
Принцип метода основан на способности аскорбиновой кислоты восстанавливать индофеноловый реактив. При титровании вытяжки исследуемого материала раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола происходит окисление аскорбиновой кислоты в дегидроаскорбиновую и восстановление индофенолового реактива. Конец титрования можно установить по изменению окраски. Окисленная форма 2,6-дихлорфенолиндофенола имеет синюю окраску в нейтральной и щелочной среде, восстановленная форма – приобретает розовую окраску в кислой среде.
Аскорбиновую кислоту извлекают из исследуемого материала 1 % раствором соляной кислоты и титруют раствором индофенолового реактива. По количеству краски, затраченной на титрование, рассчитывают содержание аскорбиновой кислоты.
Следует заметить, что точному определению содержания аскорбиновой кислоты в биологических объектах мешают другие, легко окисляемые вещества: глютатион, цистеин и т.п.
7.7.1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ВИТАМИНА С В
РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ
Берут навеску исследуемого материала 5-20 г (в зависимости от предполагаемого содержания аскорбиновой кислоты), нарезают мелкими кусочками (картофель, морковь, черемша, яблоки и т.п.) тщательно растирают в ступке со щепоткой стекла или кварцевого песка, добавляя порциями по 4-5 мл раствора с массовой долей метафосфорной или соляной кислоты 2 % до получения однородной жидкой кашицы. Смесь из ступки количественно, с помощью раствора используемой при растирании кислоты, переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и общий объем экстракта доводят до метки тем же раствором кислоты. Содержимое хорошо перемешивают, настаивают 5-7 мин и фильтруют через бумажный фильтр. Полученный фильтрат должен быть совершенно прозрачным.
Используемые для экстракции кислоты (соляная, метафосфорная, щавелевая) извлекают из исследуемого материала как свободную, так и связанную аскорбиновую кислоту, а также способствуют устойчивости аскорбиновой кислоты в экстрактах.
Берут две конические колбочки вместимостью 100-150 мл и в одну пипеткой вносят 20 мл полученного фильтрата, в другую – 20 мл раствора кислоты, используемой для растирания исследуемого материала. Содержимое колбочек титруют индофеноловым реактивом до слабо-розового цвета, удерживающегося 30 секунд. Результаты записывают, и титрование повторяют с новыми порциями того же фильтрата. На основании средней величины, полученной из 2-3 определений, рассчитывают содержание аскорбиновой кислоты по формуле:
,
(a-b) – разность между объемами индофенолового реактива, пошедшими на титрование опытной (а) и контрольной (b) проб, мл;
u - общий объем экстракта, мл;
u 1 – объем фильтрата, взятого для титрования, мл;
m – масса исследуемого материала, г,
100 – пересчет на 100г материала.
В растительных тканях в некоторых количествах содержатся и другие редуцирующие вещества, восстанавливающие 2,6-дихлорфенолиндофенол, поэтому при необходимости проведения особо точного анализа следует принять это в расчет. Для этого к двум другим порциям по 10-20 мл исследуемой вытяжки прибавляют по 0,1 или 0,2 мл 10 % раствора сернокислой меди и нагревают в термостате или сушильном шкафу 10 мин при температуре 110 ˚С. Охлаждают и титруют индофеноловым реактивом. В присутствии солей меди и при нагревании аскорбиновая кислота разрушается полностью. Полученную поправку вычитают из данных титрования опытных проб.
При анализе многих плодов и ягод, некоторых овощей получают окрашенные экстракты, что затрудняет определение аскорбиновой кислоты. Для определения аскорбиновой кислоты, окрашенную вытяжку переносят в широкую пробирку, приливают 2-5 мл дихлорэтана или хлороформа и титруют при взбалтывании раствором индофенолового реактива до появлении в слое дихлорэтана или хлороформа розового окрашивания, не исчезающего 30 сек.
При определении необходимо учитывать редуцирующую способность применяемых для экстракции кислот (смесь 20 мл 1 % соляной кислоты и 80 мл 2 % метафосфорной или 1 % щавелевой кислоты). Для этого две порции смеси кислот по 10 мл титруют индофеноловым реактивом до розового окрашивания. Полученную поправку (обычно не превышающую 0,08-0,10 мл раствора краски) вычитают из данных титрования опытных растворов.
|
2,6-ДИХЛОРФЕНОЛИНДОФЕНОЛА НАТРИЯ (ПО АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЕ)
|
|
Мaccy аскорбиновой кислоты (в мг), соответствующую 1 мл индофенолового реактива (раствора 2,6-дихлорфенолиндофенола натрия), рассчитывают пo формуле:
где М – масса аскорбиновой кислоты в мг, соответствующая 1 мл индофенолового реактива;
(u-u 1) - разность между объемами индофенолового реактива, пошедшими на титрование пробы с аскорбиновой кислотой (u) и пробы без аскорбиновой кислоты (u 1), мл;
2 – масса аскорбиновой кислоты в мг, содержащаяся в опытной пробе (основной опыт).
7.7.3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ВИТАМИНА С В МОЛОКЕ
Для определения аскорбиновой кислоты в молоке предварительно осаждают белки.
В колбочку наливают 50 мл молока и добавляют 4 мл насыщенного раствора щавелевой кислоты, взбалтывают, приливают 10 мл насыщенного раствора хлорида натрия, взбалтывают и оставляют при комнатной температуре на 5 мин. Затем содержимое колбочки фильтруют через бумажный складчатый фильтр, отмеривают пипеткой 20 мл фильтрата и титруют его индофеноловым реактивом до слабо-розового цвета, сохраняющегося 30 секунд. Берут еще 20 мл фильтрата и титрование повторяют. Для расчета берут средний результат.
Параллельно проводят контрольное определение, для чего в колбочке смешивают 50 мл воды, 4 мл насыщенного раствора щавелевой кислоты и 10 мл насыщенного раствора хлорида натрия. Далее поступают как в основном опыте.
,
где (a-b) – разность между объемами индофенолового реактива, пошедшего на титрование опытной и контрольной проб, мл;
64 – общий объем молока после добавления осадителей белка и жира;
М – масса аскорбиновой кислоты, соответствующая 1 мл индофенолового реактива (см. пункт 7.7.2.), мг;
u - объем фильтрата, взятого для титрования, мл;
u 1 - объем молока, взятого для анализа, мл.
РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; молоко свежее; картофель (лимоны,морковь, яблоки, капуста, черемша и т.п.); раствор с массовой долей метафосфорной или соляной кислоты 2 %; насыщенный раствор щавелевой кислоты; насыщенный раствор хлорида натрия; свежеприготовленный стандартный раствор аскорбиновой кислоты (в мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 100 мг аскорбиновой кислоты квалификации «медицинская» и, растворяя, объем доводят до метки раствором с массовой долей метафосфорной или соляной кислоты 2 %; индофеноловый реактив (в мерную колбу вместимостью 500 мл вносят 140-150 мг 2,6-дихлорфенолиндофенола натрия и 200-300 мл воды, энергично встряхивают до растворения краски, объем доводят до метки водой, перемешивают и фильтруют через бумажный фильтр в сухую склянку из темного стекла; раствор хранят в холодильнике не более трех суток).
Введение
Определение витамина В1 (обзор литературы)
1 Историческая справка
2 Классификация витаминов
4 Синтез витамина В1
Методы определения витаминов
1 Биологические методы
2 Химические методы
3 Физические методы
4 Физико-химические методы
Аналитическое определение витамина В1 (экспериментальная часть)
1 Потенциометрическое определение витамина В1
2 Аргентометрическое определение витамина В1
Заключение
Введение
В настоящее время на рынке появилось огромное количество витаминизированных продуктов питания для человека и кормов для животных, представляющих собой сухие многокомпонентные смеси. Ассортимент таких продуктов представлен достаточно широко. Это, прежде всего, биологически активные добавки к пище, комбикорма для животных и птиц, поливитаминные препараты. Критерием качества таких продуктов может являться их анализ на содержание витаминов и, особенно, таких жизненно необходимых, как водорастворимые и жирорастворимые витамины, количество которых регламентируется нормативными документами и санитарными нормами качества.
Витамины принадлежат к различным классам органических соединений. Поэтому для них не могут существовать общие групповые реакции; каждый из витаминов требует особого аналитического подхода.
Химическая структура витамина В1 (антиневритический витамин, аневрин, бери-бери витамин, анти-бери-бери витамин), позволяет применить различные методы химического и физико-химического количественного определения:
кислотно-основное титрование, осадительное титрование (аргентометрия), физико-химические методики (спектрофотометрические), гравиметрия.
Целью данной курсовой работы, является количественное определение витамина В1. Было выбрано два способа количественного определения- химический и физико-химический методы.
Задачи курсовой работы: Произвести анализ литературы, выполнить два количественных определения тиамина- потенциометрическим титрованием и аргентометрическим методом.
1. Определение витамина В1 (обзор литературы)
1 Историческая справка
Всем известное слово "витамин" происходит от латинского "vita" - жизнь. Такое название эти разнообразные органические соединения получили далеко не случайно: роль витаминов в жизнедеятельности организма чрезвычайно велика.
Витамины представляют собой группу разнообразных по строению химических веществ, принимающие участие во многих реакциях клеточного метаболизма. Они не являются структурными компонентами живой материи и не используются в качестве источников энергии. Большинство витаминов не синтезируются в организме человека и животных, но некоторые синтезируются микрофлорой кишечника и тканями в минимальных количествах, поэтому основным источником этих веществ является пища.
Ко второй половине XIX века было выявлено, что пищевая ценность продуктов питания определяется содержанием в них в основном следующих веществ: белков, жиров, углеводов, минеральных солей и воды.
Однако практика далеко не всегда подтверждала правильность укоренившихся представлений о биологической полноценности пищи.
Экспериментальное обоснование и научно-теоретическое обобщение этого многовекового практического опыта впервые стали возможны благодаря исследованиям русского ученого Николая Ивановича Лунина.
Он провел эксперимент с мышами, разделив их на 2 группы. Одну группу он кормил натуральным цельным молоком, а другую держал на искусственной диете, состоящей из белка-казеина, сахара, жира, минеральный солей и воды.
Через 3 месяца мыши второй группы погибли, а первой остались здоровыми. Этот опыт показал, что помимо питательных веществ, для нормальной жизнедеятельности организма, необходимы еще какие-то компоненты. Это было важное научное открытие, опровергавшее установившееся положения в науке о питании.
Блестящим подтверждением правильности вывода Н. И. Лунина установлением причины болезни бери-бери.
В 1896 году английский врач Эйкман заметил, что куры, питавшиеся полированным рисом, страдали нервным заболеванием, напоминавшим бери-бери у людей. После дачи курам неочищенного риса заболевание прекратилось. Он сделал вывод, что витамин содержится в оболочке зерен. В 1911 году польский ученый Казимир Функ выделил витамин в кристаллическом виде. Окончательное строение витамина В1 было установлено в 1973 году.
По своим химическим свойствам это вещество принадлежало к органическим соединениям и содержало аминогруппу. Функ, полагая, что во всех подобных веществах обязательно должны входить аминные группировки, предложил называть эти неизвестные вещества витаминами, т.е. аминами жизни. В дальнейшем было установлено, что многие из них аминных групп не содержат, но термин «витамин» прижился в науке и практике.
Согласно классическому определению, витамины - это необходимые для нормальной жизнедеятельности низкомолекулярные органические вещества, которые не синтезируются организмом данного вида или синтезируются в количестве, недостаточном для обеспечения жизнедеятельности организма. Витамины необходимы для нормального протекания практически всех биохимических процессов в нашем организме.
2 Классификация витаминов
Современная классификация витаминов не является совершенной. Она основана на физико-химических свойствах (в частности, растворимости) или на химической природе. В зависимости от растворимости в неполярных органических растворителях или в водной среде различают жирорастворимые и водорастворимые витамины. В приводимой классификации витаминов, помимо буквенного обозначения, в скобках указан основной биологический эффект, иногда с приставкой «анти», указывающей на способность данного витамина предотвращать или устранять развитие соответствующего заболевания.
Витамины, растворимые в жирах
Витамин Л (антиксерофгальмический); ретинол
Витамин D (антирахитический); кальциферолы
Витамин Е (антистерильный, витамин размножения); токоферолы
Витамин К (антигеморрагический); нафтохиноны
Витамины, растворимые в воде
.Витамин В1 (антиневритный); тиамин
.Витамин В2 (витамин роста); рибофлавин
.Витамин В6 (антидерматитный, адермин); пиридоксин
.Витамин В12 (антианемический); цианкобаламии; кобаламин
.Витамин РР (антипеллагрический, ниацин); никотинамид
.Витамин Н (антисеборейный, фактор роста бактерий, дрожжей и грибков); биотин
.Витамин С (антискорбутный): аскорбиновая кислота
3 Строение и свойства витамина В1
Витамин В1-тиамин является хлористоводородной солью 4-метил-5-?-оксиэтил- N - (2-метил-4-амино-5-метилпиримидил) -тиазолийхлорида, получается синтетически обычно в виде хлористо-или бромистоводородной соли. В его структуру входят такие гетероциклические системы, как пиримидил и тиазол.
Витамин В1- белый кристаллический порошок горького вкуса, с характерным запахом, хорошо растворяется в воде(1г в 1 мг), ледяной уксусной кислоте, в этиловом спирте. В сильнокислой водной среде тиамин обладает высокой устойчивостью и не разрушается под действием таких энергичных окислителей, как перекись водорода, марганцовокислый калий и озон. При рН=3,5 тиамин может нагреваться до температуры 120ºС без заметных признаков разложения.
Витамин В1 способен окисляться. В щелочной среде под действием красной кровяной соли тиамин переходит в тиохром. Превращение тиамина в тиохром количественный необратимый процесс.
Эта реакция положена в основу одного из количественных методов определения витамина В1. Превращение тиамина в тиохром сопровождается утратой витаминной способности.
1.4 Синтез
Учитывая особенности строения витамина В1, его синтез может быть осуществлен тремя путями: конденсацией пиримидинового и тиазольного компонентов, на основе пиримидинового компонента и на основе тиазольного компонента.
Рассмотрим первый вариант. Оба компонента синтезируются параллельно, а затем соединяются в молекулу тиамина. Конкретно 2- метил-4-амино-5 хлорметилпиримидин взаимодействует с 4-метил-5-оксиэтиазолом, образуя четвертичную тиазолевую соль:
Конденсация проходит при температуре 1200С в толуоле или бутиловом спирте. Далее полученный тиамин выделяют из реакционной смеси осаждением ацетоном и очищают перекристаллизацией из метанола.
5 Распространение в природе и применение
Тиамин распространен повсеместно и обнаруживается у разных представителей живой природы. Как правило, количество его в растениях и микроорганизмах достигает величин значительно более высоких, чем у животных. Кроме того, в первом случае витамин представлен преимущественно свободной, а во втором - фосфорилированной формой. Содержание тиамина в основных продуктах питания колеблется в довольно широких пределах в зависимости от места и способа получения исходного сырья, характера технологической обработки полупродуктов и т. п.
В злаковых семенах растений тиамин, подобно большинству водорастворимых витаминов, содержится в оболочке и зародыше. Переработка растительного сырья (удаление отрубей) всегда сопровождается резким снижением уровня витамина в полученном продукте. Шлифованный рис, например, совсем не содержит витамина.
Витамин В1 широко применяется в медицинской практике для лечения различных нервных заболеваний (неврозов, полиневритов), сердечно - сосудистых расстройств(гипертония) и др.
Витаминизация хлебобулочных изделий и комбикормов в животноводстве и птицеводстве.
Суточная потребность взрослого человека в среднем составляет 2-3 мг витамина В1. Но потребность в нём в очень большой степени зависит от состава и общей калорийности пищи, интенсивности обмена веществ и интенсивности работы. Преобладание углеводов в пище повышает потребность организма в витамине; жиры, наоборот, резко уменьшают эту потребность.
2. Методы определения витаминов
Все методы исследования витаминов подразделяются на биологические (микробиологические), физические, химические и физико-химические.
1 Биологические методы
Несмотря на то, что биологические методы определения некоторых витаминов отличаются высокой чувствительностью и могут использоваться для исследования образцов с незначительным содержанием этих соединений, в настоящее время они представляют главным образом исторический интерес. Точность этих методов невысока, кроме того биологические методы требуют больших затрат времени и средств и неудобны для проведения серийных анализов.
Микробиологические методы основаны на измерении скорости роста бактерий, которая пропорциональна концентрации витамина в исследуемом объекте.
2.2 Химические методы
Специфичность свойств витаминов обусловлена наличием в их молекулах функциональных групп. Это свойство широко используется при количественном и качественном химическом анализе.
Химические методы анализа:
) Фотометрический;
) Титриметрический(заключается в том, что все вещества реагируют между собой в эквивалентных количествах С*V = С*V);
3) Гравиметрический(заключается в выделении вещества в чистом виде и его взвешивании. Чаще всего такое выделение проводят осаждением. Реже определяемый компонент выделяют в виде летучего соединения(метод отгонки). Аналитический сигнал-масса);
) Оптический(основан на поглощении системой некоторого количества лучистой энергии атомами. Количество энергии поглощения находится в прямой зависимости от концентрации вещества в растворе).
3 Физические методы
Применение физических методов в анализе витаминов (например, ПМР) ограничено высокой стоимостью приборов.
Кондуктометрический - основан на измерении электропроводности раствора.
Потенциометрический(в основе метода лежит измерение зависимости равновесного потенциала электрода от активности(концентрации) определяемого иона определяемого иона. Для измерений необходимо сравнивать элемент из подходящего индикаторного электрода и электрода сравнения).
Масс-спектральный - применяется при помощи сильных элементов и магнитных полей, происходит разделение газовых смесей на компоненты в соответствии с атомами или молекулярными массами компонентов. Применяется при исследовании смеси изотопов, инертных газов, смесей органических веществ.
4 Физико-химические методы
В настоящее время в практике фармацевтического анализа находят все большее применение физико-химические методы анализа, как наиболее точные и экспрессные по своему исполнению. К ним относятся оптические, электрохимические и хроматографические методы анализа.
Среди оптических методов наибольшее распространение получили спектрофотометрические и фотоколориметрические методы, основанные на общем принципе - существовании в известных границах концентраций прямой пропорциональной зависимости между светопоглощением раствора и концентрацией растворенного вещества. Спектрофотометрический анализ по непосредственному измерению оптической плотности может быть проведен для веществ, обладающими определенными особенностями строения - в структуре должны быть хромофорные и ауксохромные группы (например, гетероатомы, системы сопряженных связей).
К достоинствам колориметрических (фотометрических) методов можно отнести доступность оборудования и средств измерения, экспрессность. Основным недостатком является низкая селективность, препятствующая применению этих методов к сложным по составу объектам. Сказывается влияние сопутствующих компонентов: провитаминов, антиоксидантов, производных витаминов, продуктов деструкции витаминов, способных подобно витаминам, давать окрашенные продукты. Встречаются трудности при подборе специфического реактива для взаимодействия с определенным витамином.
Несмотря на недостатки этого метода, для многих витаминов разработаны методики фотометрического определения.
Несмотря на разнообразие методик фотометрического определения витаминов ученые до сих пор интересуются этим методом, унифицируют старые методики и создают новые.
Хроматографические методы анализа очень распространены в фармацевтической практике. Эти методы перспективны при анализе веществ, содержащих витамины и имеющих сложную структуру.
Вплоть до относительно недавнего времени наиболее часто из хроматографических методов использовали газожидкостную хроматографию (ГЖХ).
В настоящее время альтернативным способом быстрого определения витаминов в разнообразных объектах является высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).
Определение витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии не требует длительной пробоподготовки, достаточно высока чувствительность метода, однако высокая стоимость оборудования существенно ограничивает применение этого метода.
Электрохимические методы анализа основаны на использовании ионообменных или электрообменных процессов, протекающих на поверхности электрода или в при электродном пространстве. Аналитическим сигналом служит любой электрический параметр (потенциал, сила тока, сопротивление, электропроводность и т.д.), функционально связанный с составом и концентрацией раствора.
Электрохимические методы анализа играют важную роль в современной фармацее, поскольку характеризуются высокой чувствительностью, низкими пределами обнаружения, широким интервалом определяемых содержаний. Самыми распространенными методами являются полярография и вольтамперометрия. Литературные данные по полярографическому исследованию витаминов самые многочисленные. Полярографически можно определять количественное содержание каждого витамина в индивидуальных и в сложных фармацевтических препаратах.
Метод достаточно чувствительный, но использование полярографии ограничено применением токсичного ртутного электрода.
Вместе с тем метод потенциометрического титрования является экспрессным, простым в выполнении, не требует дорогостоящего оборудования и реактивов.
3. Экспериментальная часть
1 Потенциометрическое определение витамина В1
В структуру витамина В1 входит подвижный хлор (С12Н18ОN4Cl2S):
витамин тиамин титрование потенциометрический
Это дало возможность использовать осадительное потенциометрическое титрование для определения тиамина. В качестве индикаторного электрода использовался серебряный электрод. Титрантом служил раствор нитрата серебра с концентрацией 0,05 моль/л.
Для проведения анализа готовили растворы с концентрацией витамина В1 0,02968моль/л. Для этого содержимое 10 ампул количественно переносили в колбу на 50 мл и доводили до метки дистиллированной водой. Объем ампул равен 1 мл, содержание витамина В1 - 50 мг (Производитель: ОАО «Мосхимфармпрепараты» им. Н.А.Семашко). Отбирали аликвоты, объемом по 5 мл и проводили потенциометрическое титрование. Эквивалентный объем раствора нитрата серебра при титровании 5 мл раствора витамина 6 мл. Было выполнено 8 потенциометрических измерений.
Примеры кривых титрования представлены на рисунках 1, 2, 3, 4, 5. Кривые титрования построены в координатах- интегральные кривые V, мл- Е, Вт, а дифференциальные кривые в координатах - ?V -
Рис.1 Кривая потенциометрического титрования витамина В1(Val=5 мл)
Рис.2 Кривая потенциометрического титрования витамина В1(Val=5 мл)
Рис.3 Кривая потенциометрического титрования витамина В1(Val=5 мл)
Рис.4 Кривая потенциометрического титрования витамина В1(Val=5 мл)
Рис.5 Кривая потенциометрического титрования витамина В1(Val=5 мл)
где ТAgNO3/вит.В1.= (0,05*337)/1000=0,01685г/мл; Vэ- объем нитрата серебра, пошедший на титрование.
где Vколбы = 50мл, ТAgNO3/вит.В1 =0,008425г/мл, Vэ - объем нитрата серебра, пошедший на титрование, Val = 5 мл, N - число ампул (10 шт).
Результаты анализа представлены в таблице 1.
Таблица 1. Результаты анализа потенциометрического титрования.
№V, мла, мгm, г160.10110,05055260.10110,0505536,50,10950,05476460.10110,05055560.10110,05055660.10110,05055760.10110,05055860.10110,05055<среднее>6,06250,102150,051076
где x - "подозрительное" значение (вероятный промах) - это максимальное или минимальное значение выборки, xближайшее - ближайшее к подозрительному значение, xmin и xmax - максимальное и минимальное значения выборки. Значение Q сравнивают с табличным значением(Таблица 2). Доверительную вероятность берут равной 0.90 или 0.95. Если Q> Qтабл - подозрительный результат является промахом и исключается из дальнейшего рассмотрения;Q< Qтабл - подозрительный результат не является промахом.
Таблица 2. Критические значения Q-критерия для различной доверительной вероятности p и числа измерений n.
np0.900.950.9930.9410.9700.99440.7650.8290.92650.6420.7100.82160.5600.6250.74070.5070.5680.68080.4680.5260.63490.4370.4930.598100.4120.4660.568
Вычисления: n=8; р=0.90;= =1,0>0,468 критерий свидетельствует, что результат является промахом, и мы его не учитываем.
Исключая промах получаем m= 0,05055 г, по нормативным документам содержание витамина В1 должно быть равным 0,05 г.
Погрешность составляет:
Х= 0,05055-0,05= 0,00055 г
1,1%
. Среднее квадратичное отклонение, характеризующее разброс результатов КХА:
Таблица 3. Вспомогательная таблица для расчета СКО.
mimi - (mi - )2S0,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,05055000
. Доверительный интервал:
0,05055
3.2 Аргентометрическое определение витамина В1
Аргентометрическое определение по методу Фаянса,. Метод Фаянса - это метод прямого титрования галогенидов раствором AgNO30,1М в слабо кислой среде с применением адсорбционных индикаторов, которые показывают изменение цвета не в растворах, а на поверхности выпавшего осадка. Использовали раствор, приготовленный для первого метода количественного определения тиамина с концентрацией витамина 0,02968моль/л. Val= 5 мл. Прибавляли 2-3 капли раствора бромфенолового синего и по каплям разведенную уксусную кислоту до получения зеленовато-желтого окрашивания. Полученный раствор титровали 0,1 М раствором нитрата серебра до фиолетовой окраски.
Титрование идет по уравнению:
(С12Н17N4ОS)Cl- .HCl +2AgNO3= 2AgCl + (С12Н17N4ОS)NO3- .HNO3
Таблица 4. Результаты аргентометирического определения витамина В1
№V, млm, г11,50,0505521,50,0505531,50,0505541,50,0505551,40,0471861,50,0505571,50,0505581,50,0505591,40,04718101,50,05055<среднее>1,480,04988
Приведённые результаты свидетельствуют о наличии выпадающих результатов. Определение промахов ведем по Q-критерию: Тестовая статистика Q-критерия вычисляется по формуле:
Вычисления: n=10; р=0.90;
> 0,412критерий свидетельствует, что результат является промахом, и мы его не учитываем в дальнейших расчетах.
1.Установление титра AgNO3 0,1 N по раствору NaCl 0,1 N
= ;
V-объем AgNO3, пошедший на титрование, мл.
2.Погрешность составляет:
Х= 0,05055 -0,05= 0,00055 г
1,1%
Математическая обработка результатов КХА (количественного химического анализа)
. Среднее квадратичное отклонение, характеризующее разброс результатов КХА
Таблица 5. Вспомогательная таблица для расчета СКО.
mimi - (mi - )2S0,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,050550000,050550,05055000
. Доверительный интервал:
Верхнюю и нижнюю границы интервала, в котором погрешность результатов КХА находится с доверительной вероятностью 0,95, определяли следующим образом:
0,05055
Заключение
В данной курсовой работе стояла задача количественно определить витамин В1. Для определения витаминов применяют различные методы. Так же необходимо учитывать химическое строение каждого витамина. Широко используемые оптические методы анализа трудоемки, требуют больших затрат времени и дорогостоящих реактивов, применение хроматографических методов осложнено использованием дорогостоящего оборудования. Было выбрано два метода определения тиамина:
.Потенциометрическое титрование, который имеет ряд преимуществ по сравнению с существующими методами анализа фармпрепаратов, на содержание в них витаминов: метод прост, экспрессен, не требует дорогостоящего оборудования, расход реактивов минимален, исключено влияние субъективных факторов.
По этому методу ошибка составляет 1,1%.
.Титрование, заключается в том, что все вещества реагируют между собой в эквивалентных количествах С*V = С*V
В данном методе определения тиамина ошибка составляет 1,1%.
Доверительный интервал: 0,05055.
Список используемой литературы
1. Биохимия: учеб.для вузов 3-е изд., стереотип. / В.П. Комов; В.Н. Шведова М.: Дрофа, 2008. -638 с.
Химия витаминов/ В.М. Березовский М.: «Пищевая промышленность», 1973. -632 с.
Основы аналитической химии книга 2 методы химического анализа / Ю.А. Золотов «Высшая школа» год; 2002. -494 с.
4. Аналитическая химия, учебное пособие/ Н.Я. Логинов; А.Г.Воскресенский; И.С. Солодкин-. М.: «Просвещение» 1975.- 478 с.
5. Михеева Е.В. Вольтамперометрическое определение водорастворимых витаминов В1 и В2 в витаминизированных подкормках и кормах./ Е. В. Михеева, Л. С. Анисимова // Материалы 6 конференции « Аналитика Сибири и Дальнего Востока» г.Новосибирс.-2000.-с.367.
Химические методы в количественном анализе лекарственных средств: Методическое указание для студентов V курса по «Контроль качества лекарственных средств»/ Государственный Университет Медицины и Фармации им. Н. Тестемицану.- Кишинэу.- 2008
ГОСТ 29138-91
8. Л.Н. Корсун, Г.Н. Баторова, Э.Т. Павлова/- Математическая обработка результатов химического эксперимента: учебное пособие для студентов химических, медицинских и биологических специальностей и направлений-Улан-Удэ.- 2011.-70 с.
Репетиторство
Нужна помощь по изучению какой-либы темы?
Наши специалисты проконсультируют или окажут репетиторские услуги по интересующей вас тематике.
Отправь заявку
с указанием темы прямо сейчас, чтобы узнать о возможности получения консультации.
