Правила забора крови на определение мутаций в генах человека ПЦР диагностику
Кровь на ПЦР диагностику . Забор крови производится натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8-1,1 мм) в одноразовый шприц объемом 2-5 мл и переносится в пробирку с ЭДТА или специальную вакуумную систему типа “Veccuette” (с ЭДТА с сиреневой крышкой), пробирка закрывается пробкой и переворачивается несколько раз (для перемешивания с антикоагулянтом).
Пробирка с кровью до исследования хранят в холодильнике при +4°С — +8°С. Максимальный срок хранения: Кровь, собранная в пробирку с ЭДТА, для определения мутаций в генах BRCA1/2, может храниться при +4°С — +8°С 2 дня.
Правила забора крови на определение ПЦР – исследований инфекций
Для получения плазмы забор крови производят натощак или через 3 часа после приема пищи из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0,8-1, 1 мм) в специальную вакуумную систему (сиреневые крышки – 6% ЭДТА). Пробирку закрывают крышкой и аккуратно переворачивают несколько раз вверх дном, чтобы кровь в пробирке тщательно перемешалась с антикоагулянтом (в противном случае кровь свернется, и выделение ДНК/РНК станет невозможным).
Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя!
Условия хранения и перевозки материала и предварительно обработанных проб
Образцы цельной крови: -при температуре 20-25ºС – в течение 2 часов; -при температуре 2-8ºС – в течение 6 часов с момента взятия материала для количественного определения нуклеиновых кислот; в течение 12 ч – для качественного определения нуклеиновых кислот;
Недопустимо замораживание образцов цельной крови!
Забор материала на ПЦР ВПЧ инфекций
Для исследования на ВПЧ необходимо достаточное количество эпителиальных клеток, т.к. вирус является внутриклеточным агентом. Допустимо умеренное присутствие примесей в виде цервикальной слизи и крови. В ряде случаев возможно взятие материала с помощью универсального гинекологического зонда, однако при этом объем соскобного отделяемого будет меньше, а количество клеток может быть недостаточным.
Удаляют слизь и отделяемое влагалища с поверхности шейки матки стерильным марлевым тампоном, вводят рабочую часть цитощетки в цервикальный канал и делают два-три полных оборота по часовой стрелке. Извлекают цитощетку и помещают ее рабочую часть, содержащую взятый материал, в пробирку с транспортной средой. Рабочую часть цитощетки обламывают не более 1 см пластиковой основы цитощетки и оставляют в пробирке с транспортной средой.
В случае невозможности обломить рабочую часть цитощетки или универсального зонда, следует максимально полно смыть клинический материал с их рабочей части в пробирку с транспортной средой, прижав ее к внутренней стороне пробирки и вращая по 5-10 раз по часовой и против часовой стрелки.
Недопустимо использование многоразовых ножниц для обрезания рабочей части цитощетки или универсального зонда – это может привести к перекрестной контаминации клиническим материалом и, как следствие, получению ложно-положительных результатов.
Пробирки с биологическим материалом до исследования хранят в морозилке при -16°С.
Забор материала на ПЦР диагностику у мужчин
Соскоб (мазок). Забор материала производится универсальным зондом из уретры. При необходимости материал для исследования берется из генитальных язв (исследование на HSV-II). Рабочая часть зонда, содержащая исследуемый материал, отрезается или обламывается и помещается в одноразовую пробирку типа “Эппендорф” с консервирующим раствором либо тщательно перемешивается вращательным движением, остатки жидкости на зонде отжать о стенки пробирки, зонд извлечь (выбросить в контейнер с дезинфицирующим раствором).
Пробирки с биологическим материалом до исследования хранят в морозилке при -18°С.
Сперма. Собирают в одноразовую сухую пробирку типа «Эппендорф». Максимальный срок хранения 1 сутки в холодильнике при температуре +4°С — +8°С; при -18°С — -20°С не более 2-х недель.
Сок предстательной железы . После окончания массажа предстательной железы сок в количестве 0,5-1 мл собирают в одноразовую сухую пробирку типа “Эппендорф”. При невозможности получить сок, сразу после массажа собирают первую порцию мочи (в которой содержится сок предстательной железы) в количестве 10 мл.
Максимальный срок хранения 1 сутки в холодильнике при температуре +4°С — +8°С; при -18°С — -20°С не более 2-х недель.
Пример стандартной операционной процедуры по приему биоматериала в медицинскую лабораторию.
|
НАИМЕНОВАНИЕ УЧРЕЖДЕНИЯ |
||
|
Вид документа |
Стандартная операционная процедура (СОП) |
|
|
Запись в Едином реестре документации лаборатории |
СОП-ПА-01-2014 |
|
|
Экземпляр |
||
|
Общее количество страниц |
||
|
Введена в действие |
||
|
Срок действия |
||
|
Название документа |
Правила приема и регистрации биоматериала в лаборатории. |
|
|
Должность |
||||
|
Разработал: |
||||
|
Проверил: |
||||
|
Согласовано: |
Колонтитул:
|
Наименование |
||
|
Область применения |
||
|
Организация процесса транспортировки биоматериала курьером |
||
|
Прием биоматериала в лаборатории |
||
|
Передача биоматериала и направлений в соответствующие подразделения лаборатории |
||
|
Регистрация бланков-заказов операторами. |
||
|
Приложение №1 Блок-схема |
||
|
Приложение № 2 Виды несоответствий и их устранение |
||
|
Приложение № 3 Датчик температуры холодильника машины |
||
|
Приложение № 4 Бланк-направление |
||
|
Приложение № 5 Лист-ознакомления сотрудников с СОП |
||
1. Область применения
Настоящая стандартная операционная процедура (далее- СОП) определяет порядок приема, регистрации биоматериала, поступающего в лабораторию из процедурного кабинета НАИМЕНОВАНИЕ УЧРЕЖДЕНИЯ и других учреждений, обслуживаемых лабораторией, а также выявление несоответствий и их устранение.
Настоящая СОП предназначена для фельдшера-лаборанта и оператора лаборатории.
- Методические рекомендации « Организация преаналитического этапа при централизации лабораторных исследований крови» (Одобрены на Общероссийской научно-практической конференции «Реальные клинико-диагностические лабораторные услуги: степень соответствия стандартам лабораторной медицины, качество, себестоимость и цена» (Москва, 2-4 октября 2012 г.)
- ГОСТ Р 53079.4─2008. «Технологии медицинские лабораторные. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа». Введен в действие с 1.01.2010 года.
- ISO 15189:2012 «Лаборатории медицинские. Требования к качеству и компетентности»
3. Организация процесса транспортировки биоматериала курьером и ответственность курьера.
3.1. Температуру в холодильнике, которая указана на дисплее в салоне машины, курьер фиксирует в журнале «Журнал учета температурного режима в холодильниках машин », а также в данном журнале курьер указывает свое ФИО, регистрационный знак машины и время отправления машины за биоматериалом непосредственно перед поездкой в учреждения. Данный журнал находится в кабинете №___. (Фото температурного датчика и фото формы журнала приведены в приложении № 3).
3.2. Курьер, прибыв в ЛПУ, идет в регистратуру данного учреждения, где забирает контейнеры с разным биоматериалом. На каждом контейнере указаны название учреждения и тип биоматериала (кровь, моча, кал, предметные стекла с мазками, соскобы). Курьер размещает контейнеры в горизонтальном положении в холодильник машины, как это показано на фотографии.
3.3. Курьер отвечает за целостность контейнеров, их сохранность, за обеспечение должного температурного режима в холодильнике машины (+4 - +8 о С), а также за сохранность биоматериала, доставляемого из учреждений в лабораторию. Во время пути курьер отслеживает температуру в холодильнике машины, которая выводится на дисплей, установленный в салоне машины.
4. Прием биоматериала в лаборатории.
4.1.Температуру, которая указана на табло в холодильнике машины на момент изъятия контейнеров, курьер отмечает в журнале «Журнал учета температурного режима в холодильниках машин » в графе, соответствующей государственному номеру машины. А также в этом же журнале водитель указывает время прибытия машины с биоматериалом из учреждений.
4.2. Курье передает промаркированные контейнеры с образцами крови, мазками и соскобами фельдшеру-лаборанту в кабинет №___.
4.3. Курье передает промаркированные контейнеры с мочой и калом фельдшеру- лаборанту в кабинет №___ .
4.4. В кабинете № ___ фельдшер-лаборант открывает крышку контейнера и извлекает оттуда пробирки с кровью, предметные стекла с мазками и соскобами, папки с направлениями на исследования.
4.5. Фельдшер- лаборант сортирует пробирки с кровью отдельно по штативам, согласно типу пробирок (биохимических, гематологических и коагулологических) и названиям учреждений, которые указаны на штативах.
4.6. В кабинете №____ фельдшер-лаборант извлекает из контейнера образцы с мочой, калом и направления.
5. Передача биоматериала и направлений в соответствующие подразделения лаборатории.
5.1 В кабинете №____ фельдшер -лаборант ставит штативы с пробирками для биохимических, иммунологических, коагулологических исследований в контейнеры с маркировкой « для переноса биоматериала» и относит их в кабинет №___ для центрифугирования.
5.2 Фельдшер-лаборант звонит в отделы гематологии и ПЦР для того, чтоб фельдшеры-лаборанты из соответствующих отделов забрали биоматериал из кабинета №___
5.3. Фельдшер-лаборант передает направления на исследования из кабинета №___ операторам в кабинет №____ для регистрации.
5.4 В кабинете №___ фельдшер-лаборант передает направления операторам, которые регистрируют бланки в том же кабинете.
6. Регистрация бланков-заказов операторами.
6.1. Операторы в кабинете №___, получив бланки-направления от фельдшера-лаборанта из кабинета №___, регистрируют их в лабораторной информационной системе.
Порядок регистрации:
Оператор считывает штрих-код сканером, наклеенный на бланк- направление;
Затем оператор вводит в ЛИС паспортные данные пациента: ФИО, дату рождения, адрес проживания и другие данные: источник заказа (ОМС, ДМС, наличный расчет, диспансеризация), номер учреждения, отделение, ФИО врача, назначившего исследования, диагноз, код МЭС (медико-экономический стандарт).
После этого оператор вносит в ЛИС те показатели, которые назначил лечащий врач, и сохраняет сформированный заказ в ЛИС. Бланк-направление представлен в приложении № 4.
Приложение № 2
В иды несоответствий и их устранение
|
Вид несоответствия |
Описание действий |
Исполнитель |
Ответственный |
|
Нарушение целостности контейнера |
Сообщить об этом старшему лаборанту лаборатории |
фельдшер-лаборант |
Старший лаборант |
|
Отсутствие направлений на исследования в контейнере |
Фельдшер-лаборант сообщает об этом старшему лаборанту лаборатории, который должен связаться по телефону со старшей мед. Сестрой данного учреждения |
фельдшер-лаборант |
Старший лаборант |
|
Проливание биологического материала в контейнере |
1. Сообщить об этом старшему лаборанту лаборатории 2. Аккуратно удалить все содержимое из контейнера 3. Провести дезинфекцию самого контейнера и всего содержимого контейнера, что соприкасалось с пролитым биоматериалом. |
фельдшер-лаборант |
Старший лаборант |
|
Испорченный бланк-направление (порвался, пролилось содержимое контейнера и т.д.) |
1. Фельдшер-лаборант в случае читабельности направления, переносит всю информацию на новый бланк. 2. В случае нечитабельности направления, фельдшер - лаборант сообщает старшему лаборанту, который связывается с старашей мед. Сестрой учреждения. |
фельдшер-лаборант |
Старший лаборант |
|
Битое(ые) предметные стекла в контейнере |
Фельдшер-лаборант сообщает об этом старшему лаборанту лаборатории, который должен связаться по телефону со старшей мед. Сестрой данного учреждения и доложить о данном несоответствии |
фельдшер-лаборант |
Старший лаборант |
|
Отсутствие штрих-кода на пробирке |
1.Фельдшер-лаборант сообщает об этом старшему лаборанту лаборатории, который должен связаться по телефону со старшей мед. Сестрой данного учреждения и доложить о данном несоответствие. 2. Данное несоответствие фельдшер-лаборант вносит в в журнал «Регистрации брака» |
фельдшер-лаборант |
Старший лаборант |
|
Бланк-направление, оформленный в ненадлежащим виде |
1. Фельдшер-лаборант сообщает об этом старшему лаборанту лаборатории, который должен связаться по телефону со старшей мед. Сестрой данного учреждения 2. Фельдшер-лаборант данное несоответствие заносит в журнал «Регистрации брака» 3. На следующий день фельдшер -лаборант отправляет данное направление в то учреждение, из которого оно поступило, для переписывания бланка-направления врачом в читабельном виде. |
фельдшер-лаборант |
Старший лаборант |
Приложение № 3
Датчик температуры холодильника машины
В данном приложении также полезно привести форму журнала, который должен заполнять водитель.
В последующих приложениях приводятся форму бланка-направления и т.д.
Кафедра клинической лабораторной диагностики с курсом ФПК и ПК
Перечень разделов по дисциплине клиническая лабораторная диагностика для подготовки к выполнению аудиторных контрольных работ в зимнюю лабораторно-экзаменационную сессию студентами 6 курса заочной формы обучения.
1. Организационная структура клинико-диагностической лаборатории.
2. Общеклинические лабораторные исследования.
3. Гематологические лабораторные исследования.
4. Лабораторные методы оценки гемостаза.
5. Биохимические лабораторные исследования.
6. Контроль качества лабораторных исследований.
Перечень контрольных вопросов по дисциплине клиническая лабораторная диагностика для подготовки к выполнению аудиторных контрольных работ в зимнюю лабораторно-экзаменационную сессию студентами 6 курса заочной формы обучения.
Структурная организация клинико-диагностической лаборатории.
Нормативные документы и приказы МЗ РБ, регламентирующие работу клинико-диагностической лаборатории.
Оборудование клинико-диагностической лаборатории.
Основная измерительная и аналитическая аппаратура клинико-диагностической лаборатории.
Основы техники безопасности и правила санэпидрежима при работе в клинико-диагностической лаборатории.
Правила взятия, доставки, приема, оформления и регистрации биологического материала.
Общеклинические лабораторные исследования.
Подготовка пациента к исследованию, сбор, хранение и обработка материала для общего анализа мочи.
Физические свойства мочи: цвет, прозрачность, запах, рН, относительная плотность мочи.
Химические свойства мочи, методы определения общего белка (качественный и количественный методы, методы «сухой химии»).
Определение глюкозы в моче при помощи индикаторной бумаги и глюкозооксидазным методом.
Правила приготовления нативного препарата мочевого осадка.
Количественное определение элементов организованного осадка мочи.
Определение элементов неорганизованного осадка.
Виды неорганизованных осадков.
Общий клинический анализ крови.
Характеристика методов определения СОЭ, концентрации гемоглобина, подсчета количества эритроцитов, цветового показателя, лейкоцитов и лейкоцитарной формулы.
Правила подготовки пациента, забор, хранение и обработка материала для общего клинического анализа крови.
Нормальные значения и пределы физиологических колебаний уровня эритроцитов и лейкоцитов периферической крови.
Правила приготовления препарата и подсчета в камере Горяева.
Метод определения гемоглобина крови гемоглобинцианидным методом.
Современное представление о костно-мозговом кроветворении.
Процентное содержание лейкоцитов в периферической крови. Диагностическое значение лейкоцитарной формулы.
Лабораторные исследования, характеризующие свертывающую систему крови.
Понятие о системе свертывания крови.
Первичный гемостаз. Лабораторные методы исследования первичного гемостаза.
Фазы коагуляционного гемостаза.
Фибринолиз.
Антикоагулянтная система.
Лабораторные методы оценки вторичного гемостаза.
Лабораторные исследования, характеризующие биохимические показатели крови.
Лабораторные показатели, характеризующие белковый обмен. Определение общего белка в сыворотке крови биуретовым методом.
Остаточный азот и его компоненты. Методы определения мочевины, креатинина, мочевой кислоты.
Методы исследования ферментов. Клинико-диагностическое значение определения активности ферментов.
Биологическая роль углеводов. Определение содержания глюкозы ферментативным методом.
Липопротеины плазмы крови. Лабораторные показатели липидного обмена.
Образование и метаболизм желчных пигментов. Клинико-диагностическое значение исследования показателей пигментного обмена.
Аналитическая надежность и контроль качества клинических лабораторных исследований.
Аналитическая оценка лабораторных результатов. Виды ошибок, их характеристика.
Внутрилабораторный контроль качества. Методы контроля воспроизводимости результатов исследования. Контроль правильности результатов исследования.
C оставление аналитического лабораторного заключения.
Аналитическое лабораторное заключение составляется по условиям ситуационной задачи.
На основании их анализа предложенных лабораторных данных необходимо ответить на следующие вопросы:
Принцип, лежащий в основе анализируемого метода;
Необходимое оборудование;
Правила подготовки исследуемого материала и основные источники ошибок возможных при выполнении данного метода;
Единицы измерения;
Понятие о референтных значениях. Клинико-диагностическое значение анализируемого метода.
Практические навыки:
Организация рабочего места для выполнения лабораторных исследований;
Приготовление реагентов в необходимой концентрации;
Прием, маркировка и хранение биологического материала;
Выполнение общего анализа крови;
Выполнение общего анализа мочи;
Выполнение гемостазиологического исследования;
Выполнение биохимических исследований;
Оформение результатов лабораторных исследований;
Правила взятия, хранения и транспортировки биоматериала
Для выявления возбудителей заболеваний методом ПЦР
1.1.1. Взятие биоматериала производится из предполагаемого места обитания микроорганизмов и развития инфекции.
1.1.2. Количество забранного материала должно быть небольшим. Избыток отделяемого, слизь и гной отрицательно влияют на качество выделения ДНК и способствуют деградации ДНК при хранении и транспортировке.
1.1.3. При внесении биоматериала, взятого у пациента зондом с ватным тампоном или щеточкой, в пробирку типа эппендорф с буферным раствором, необходимо:
Соблюдать стерильность;
Прежде, чем погружать собранный на тампоне (щеточке) биоматериал в раствор, размазать его по сухой стенке пробирки, затем смочить тампон (щеточку) в растворе и, вращая зонд, тщательно смыть весь материал со стенки пробирки и тампона (щеточки);
По возможности отжать тампон о стенку пробирки, удалить зонд с тампоном (щеточкой) и закрыть пробирку.
Способы взятия биоматериала для исследований методом ПЦР
1.2.1. Соскобы. Для соскобов используются одноразовые стерильные зонды, имеющие ватный тампон с повышенной адсорбцией или «щеточки», реже - ложки Фолькмана, малые ушные ложки или аналогичные инструменты со слегка затупленными краями. Поскабливающими движениями собрать материал. Исследуемый материал должен содержать возможно большее количество эпителиальных клеток и минимальное количество слизи, примесей крови и экссудата. Внести материал в стерильную пробирку типа эппендорф с буферным раствором (см. раздел 1.1.).
Соскоб из цервикального канала: перед взятием соскоба необходимо удалить избыток слизи стерильным ватным тампоном, обработать шейку матки стерильным физиологическим раствором. Зонд ввести в цервикальный канал на глубину 0,5-1,5 см, избегая соприкосновения со стенками влагалища, и поскабливающим движением (не до крови) собрать материал. Небольшое количество эритроцитов в пробе не влияет на результат анализа. При наличии эрозии шейки матки материал берут с границы здоровой и измененной ткани.
Соскоб из уретры: зонд ввести в уретру (у мужчин - на глубину 2-4 см) и несколькими вращательными движениямисобрать материал. Накануне перед взятием материала допускается провокация (острая пища, алкоголь и др.). Рекомендуется воздержаться от мочеиспускания в течение 1-2-х часов перед взятием пробы. При наличии обильных гнойных выделений соскоб надо брать не позже, чем через 15 минут после мочеиспускания.
Соскоб с конъюнктивы берут, предварительно проведя анестезию глаза 0,5% раствором дикаина. Вывернув веко, зондом с ватным тампоном (либо глазным скальпелем) собрать эпителиальные клетки с конъюнктивы.
Соскоб из прямой кишки: зонд ввести в анальное отверстие на глубину 3-4 см и вращательным движением собрать материал.
1.2.2. Мазки. Одноразовым стерильным зондом с ватным тампоном или щеточкой взять небольшое количество отделяемого (со сводов влагалища, из зева, носоглотки и др.) и перенести в стерильную пробирку типа эппендорф с буферным раствором (см. раздел 1.1.).
1.2.3. Кровь. Для исследований методом ПЦР кровь должна быть нативной (не свернувшейся).
Кровь собрать асептически, путем венопункции - в фирменную пробирку (2-3 мл) с антикоагулянтом ЭДТА (гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя! ), аккуратно перемешать, плавно переворачивая пробирку.
Кровь с ЭДТА является биоматериалом для следующих групп исследований:
- генетические исследования (момент забора крови значения не имеет).
- выявление возбудителей инфекций (наиболее информативными являются пробы, взятые при ознобе, повышенной температуре, т. е. предположительно во время виремии или бактериемии).
1.2.4. Моча. В пустой стерильный контейнер с плотно завинчивающейся крышкой собирают утреннюю первую или среднюю порцию мочи в количестве минимум 10 мл. Если забор мочи проводят днем, то перед этим пациент не должен мочиться 1,5-3 часа.
1.2.5. Мокрота. Утром провести санацию ротовой полости и горла (прополоскать раствором питьевой соды). Собрать мокроту в пустой стерильный широкогорлый флакон.
1.2.6. Биоптат. Взятие материала осуществлять из зоны предполагаемого местонахождения возбудителя инфекции, из поврежденной ткани или пограничного с повреждением участка. Поместить биоптат в стерильную пробирку типа эппендорф с буферным раствором.
1.2.7. Слюна, желудочный сок, ликвор, синовиальная жидкость. Слюна (1-5 мл), желудочный сок (1-5 мл), ликвор (1-1,5 мл) - поместить в пустую стерильную пробирку (контейнер).
1.2.8. Сок предстательной железы. После массажа предстательной железы сок собирают в количестве 0,5-1 мл в пустую стерильную пробирку (контейнер). При невозможности получить сок, сразу после массажа собирают первую порцию мочи в количестве не более 10 мл (в этой порции содержится сок предстательной железы).
1.2.9. Смывы, бронхоальвеолярный лаваж (БАЛ). Стерильным ватным тампоном и 5-7 мл физиологического раствора проводят смыв, например, с наконечника эндоскопа или бронхоскопа, и помещают 0,5-5 мл смыва в пустую стерильную пробирку (контейнер).
1.2.10. Фекалии. Зонд с ватным тампоном помещают внутрь каловых масс и слегка проворачивают, захватывая небольшое количество материала. Затем материал помещают в стерильную пробирку типа эппендорф с буферным раствором.
Оптимальное время исследования крови – в интервале от 1 до 4 часов после взятия.В промежутке от 5 до 30 минут происходит временная адаптации тромбоцитов к антикоагулянту и их агрегация, что может привести к их ложному снижению в пробе крови.
Нежелательно исследовать кровь позднее 8 часов после взятия, т.к. изменяются некоторые характеристики клеток: снижается объем лейкоцитов, повышается объем эритроцитов, что в конечном итоге приводит к ошибочным результатам измерения и неправильной интерпретации результатов. Только концентрация гемоглобина и количество тромбоцитов остаются стабильными в течение суток хранения крови.
Кровь нельзя замораживать. Капиллярную кровь с К 2 ЭДТА следует хранить при комнатной температуре и анализировать в течение 4 часов после взятия.
При необходимости проведения отсроченного анализа (транспортировка на отдаленные расстояния, техническая неполадка прибора и т. д.), пробы крови хранят в холодильнике (4 о – 8 о С) и исследуют в течение 24 часов. Однако при этом следует учитывать, что происходит набухание клеток и изменение параметров, связанных с их объемом. У практически здоровых людей эти изменения не носят критического характера и не сказываются на количественных параметрах, но при наличии патологических клеток, последние могут изменяться или даже разрушаться в течение нескольких часов с момента взятия крови.
Непосредственно перед исследованием кровь должна быть тщательно перемешана в течение нескольких минут для разведения антикоагулянта и равномерного распределения форменных элементов в плазме. Длительное постоянное перемешивание образцов до момента их исследований не рекомендуется вследствие возможного травмирования и распада патологических клеток.
Исследование крови на автоматическом анализаторе проводится при комнатной температуре. Кровь, хранившуюся в холодильнике, необходимо вначале согреть до комнатной температуры, так как при низкой температуре увеличивается вязкость крови, и форменные элементы имеют тенденцию к склеиванию, что в свою очередь, приводит к нарушению перемешивания и неполному лизису. Исследование холодной крови может быть причиной появления «сигналов тревоги» вследствие компрессии лейкоцитарной гистограммы.
При выполнении гематологических исследований на значительном удалении от места взятия крови неизбежно возникают проблемы, связанные с неблагоприятными условиями транспортировки. Воздействие механических факторов (тряска, вибрация, перемешивание и т.д.), температурного режима, вероятность пролива и загрязнения проб могут оказывать влияние на качество анализов. Для устранения этих причин при перевозках пробирок с кровью рекомендуется использовать герметично закрытые пластиковые пробирки и специальные транспортные изотермические контейнеры. Во время транспортировки не допускается контакт образца (с нативным материалом) и бланка-направления, в соответствии с правилами биологической безопасности.
^ 4.3. Прием и регистрация биологического материала
Пробирки с образцами венозной крови доставляют в лабораторию в день взятия в в штативах в специальных сумках-саквояжах для доставки биологического материала, в которых пробирки должны находиться в вертикальном положении, а при транспортировке на удаленное расстояние - в специальных контейнерах.
Сотрудник лаборатории, принимающий материал, должен проверить:
Правильность оформления направления: в бланке–направлении указываются данные обследуемого (фамилия, имя и отчество, возраст, № истории болезни или амбулаторной карты, отделение, диагноз, проведенная терапия);
Маркировку пробирок с образцами крови (на них должны быть нанесены код или фамилия больного, идентичные коду и фамилии в бланке направления материала для исследования). Лаборант должензарегистрировать доставленный материал, отметить количество пробирок.
^ 4.4 Подсчет клеточного состава крови на гематологическом анализаторе
Подсчет клеточного состава крови на гематологическом анализаторе должен проводиться в строгом соответствии с инструкцией к прибору.
При работе на гематологическом анализаторе следует:
Использовать кровь, стабилизированную К- 2 ЭДТА в рекомендованной пропорции для конкретной соли и одноразовые пробирки для гематологических исследований (простых или вакуумных);
Перед анализом осторожно, но тщательно перемешать пробирку с кровью (рекомендуется для этой цели использовать устройство для перемешивания образцов крови - ротомикс);
Использовать реактивы, зарегистрированные в установленном порядке; при смене реактивов на продукцию другого производителя следует проверить и установить калибровку прибора;
Запускать прибор, соблюдая все стадии промывки, добиваясь нулевых (фоновых) значений показателей по всем каналам;
Обращать внимание на сообщения прибора о вероятных систематических ошибках: помнить, что увеличение МСНС выше нормальных значений, как правило, результат ошибки измерения;
При выявлении ошибки обязательно устранить причину, не работать на неисправном приборе;
Выполнять процедуру контроля качества по соответствующей программе. с оценкой полученного результата;
Работать осмысленно, сопоставляя получаемые результаты с клинической характеристикой проб больного;
После окончания измерений тщательно промыть анализатор;
При остановке прибора на длительный срок обязательно выполнить все процедуры консервации (по возможности совместно с сервис-инженером);
При возникновении технических проблем следует воспользоваться помощью сервис-инженера фирмы, имеющей лицензию на техническое обслуживание; не доверять работу необученному персоналу.
Приступая к работе на гематологическом анализаторе, следует учесть границы линейности измерения анализируемых параметров. Оценка проб со значениями анализируемых параметров, превышающих границу линейности измерения, может привести к ошибочным результатам. В большинстве случаев при анализе проб с гиперцитозами анализатор вместо значения измеряемого параметра выдает значок "D" (dilute), что указывает на необходимость разведения пробы и повторного измерения. Разведение необходимо проводить до тех пор, пока не будут получены схожие итоговые результаты при двух ближайших разведениях.
^ П р и м е р ─ Анализ пробы больного с гиперлейкоцитозом на трех различных гематологических анализаторах представлен в таблице.
Таблица 3
¦Результаты подсчета количества при гиперлейкоцитозе, выполненные на трех различных гематологических анализаторах
| ^ Гематологические анализаторы | Степень разведения пробы | Итоговое значение |
|||
| ^ Цельная кровь | 1:1 | 1:3 | 1:4 | WBC |
|
| 1 | D | 274,5 | 274,5 | 143,1 | 715,5 |
| 2 | 322,6 | 253,2 | 177,7 | 141,8 | 709,0 |
| 3 | D | D | 168,3 | 139,1 | 695,5 |
Из таблицы видно, что при анализе цельной крови только один анализатор (2-й) дал цифровое значение количества лейкоцитов, два других указали на необходимость разведения пробы. Последующее поэтапное измерение пробы в трех разведениях позволило добиться близких конечных результатов на всех приборах только при разведении 1:3 и 1:4. Таким образом, итоговое количество лейкоцитов составило 700,0 - 710,0 x 10 9 /л, что более чем в 2 раза превышает первоначальное значение, полученное в цельной крови на 2-м анализаторе и в 1,5 - при разведении 1:1 на 1-м и 2-м анализаторах.
^ Калибровка гематологических анализаторов
Которой достигается равенство нулю систематической составляющей погрешности (нулевое смещение) или подтверждается, что смещение равно нулю с учетом погрешности калибровки. Калибровка гематологических анализаторов может быть выполнена двумя основными способами:
По цельной крови;
По образцам стабилизированной крови с аттестованными значениями.
^ 5.1 Калибровка по цельной крови
Калибровка по цельной крови может быть выполнена путем сравнения с референтным анализатором, калибровка которого верифицирована и может быть принята за исходную.
Для калибровки путем сравнения с референтным анализатором используется 20 образцов венозной крови пациентов, выбранных произвольно из дневной программы исследований лаборатории, располагающей референтным анализатором. Кровь должна быть взята в вакуумные пробирки с антикоагулянтом К 2 ЭДТА. После анализа на референтном анализаторе пробирки с кровью доставляются лабораторию для анализа на калибруемом приборе. Время между измерениями на референтном и калибруемом анализаторе не должно превышать 4 часа. Анализ калибровочных проб на калибруемом приборе должен выполняться таким же способом, как и анализ проб пациентов. Полученные результаты заносятся в таблицу по форме, приведенной в Приложении 1. Данные результаты используются для определения соответствующих калибровочных факторов, которые численно равны коэффициентам наклона калибровочных прямых, проходящих на графике через начало координат.
Калибровочные факторы рассчитываются на компьютере с использованием программы EXCEL, входящей в состав пакета Microsoft OFFICE любой версии. Для расчета калибровочных факторов в данной программе строится точечная диаграмма, где по оси Х откладываются измеренные значения, по оси Y – референтные, задается линия регрессии через начало координат. Программа рисует калибровочную прямую и определяет ее наклон, который и является искомым калибровочным фактором. При выявлении грубых ошибок – точек значительно отстоящих на графике от калибровочной прямой, их необходимо удалить из расчета (стереть всю строку в таблице EXCEL). Полученный калибровочный фактор заносится в таблицу Приложения 1 и используется для ручной корректировки калибровки прибора в соответствие с его инструкцией по эксплуатации.
^ Калибровка по образцам стабилизированной крови с аттестованными значениями
Во всех случаях, когда возможно, следует использовать калибраторы, специально предназначенные изготовителем для калибровки конкретного типа анализатора. Погрешности установленных значений в современных гематологических калибраторах в основном соответствуют медицинским требованиям. Однако не для всех типов анализаторов такие калибраторы имеются. Кроме того, ввиду ограниченного срока сохранности (как правило, не более 45 дней) не всегда имеется возможность получать непросроченные образцы.
Контрольные материалы не предназначены изготовителем для целей калибровки: допуски для значений значительно шире, методы аттестации и производственного контроля не такие строгие как для калибраторов. При проведении калибровки, контрольные материалы могут быть использованы лишь как один из источников информации о метрологических свойствах прибора.
Следует, однако, иметь ввиду, что при использовании для целей калибровки как контрольных материалов, так и калибраторов, особенности пробоподготовки и эксплуатации анализаторов оказывают существенное влияние на составляющие систематической погрешности. Данные влияющие факторы не могут быть учтены при калибровке коммерческими материалами. Вследствие этого, во всех случаях, проведенная калибровка должна быть верифицирована путем анализа статистики получаемых результатов в пробах пациентов (эритроцитарные индексы, интервалы нормальных значений).
5.2.1 Периодичность калибровки гематологических анализаторов
Требования к периодичности калибровки обычно содержатся в инструкции по эксплуатации анализатора. Как правило, калибровка требуется после ремонта или в случае выявления значимого дрейфа в процедурах внутрилабораторного контроля качества.
5.2.2 Процедура калибровки
Процедура калибровки выполняется в соответствии с инструкцией по эксплуатации анализатора.
5.2.3 Контроль результата калибровки
Данный контроль заключается в анализе калибровочного образца сразу после выполнения калибровки. Выполненная калибровка принимается, если результаты анализа соответствуют калибровочным значениям с учетом аналитической вариации анализатора.
5.2.4 Верификация калибровки с помощью эритроцитарных индексов
В этом способе проверки и уточнения калибровки используется тот факт, что средние значения эритроцитарных индексов – МСНС, МСН и MCV по пациентам имеют довольно малую вариацию и поэтому могут эффективно использоваться для контроля калибровки и дальнейшего контроля качества. Рекомендуемое число проб для усреднения равняется 20. Для определения среднего значения МСНС могут быть использованы любые пробы пациентов, в то время, как для определения средних МСН и MCV следует исключать пациентов с анемиями.
Многие современные гематологические анализаторы имеют встроенные программы расчета текущих средних, что значительно облегчает обработку данных.
Целевые значения эритроцитарных индексов при усреднении по 20 пробам пациентов в возрасте от 18 до 60 лет независимо от пола приведены в таблице 4.
Таблица 4
Целевые значения эритроцитарных индексов
Если полученные средние значения вышли за контрольный допуск, то это означает, что калибровка MCV или Hgb или RBC нуждается в корректировки.
При выяснении причин неудовлетворительной калибровки по результатам исследования эритроцитарных параметров при использовании коммерческих калибровочных/контрольных материалов следует принимать во внимание следующую оценку надежности аттестованных значений материалов:
Наиболее точным и стабильным во времени параметром является концентрация эритроцитов;
Стабильным параметром является Hgb, но он может зависеть от применяемых реактивов (например, циановые или бесциановые);
Самым нестабильным параметром является MCV. Значение MCV имеет тенденцию к изменению в течение всего срока годности материала в довольно широком интервале значений. При уточнении калибровки по MCV данные, полученные из анализа средних по эритроцитарным индексам, имеют приоритет над аттестованными значениями в образцах стабилизированной крови.
Считая калибровку по RBC правильной, в таблице 5 указаны возможные причины выхода средних значений индексов за контрольный допуск.
Таблица 5
Причины выхода за пределы средних значений эритроцитарных индексов
| Эритро-цитарные индексы | Среднее значение индекса | Среднее значение индекса | Среднее значение индекса | Среднее значение индекса |
| MCHC | Ниже границы | Выше границы | Выше границы | Ниже границы |
| MCH | В границах допуска | В границах допуска | Выше границы | Ниже границы |
| MCV | Выше границы | Ниже границы | В границах допуска | В границах допуска |
| Причина | Завышен MCV | Занижен MCV | Завышен Hgb | Занижен Hgb |
