Механизм развития (патогенез) многих генных заболеваний человека связан с нарушением тех или иных звеньев обмена веществ, сопровождающихся появлением в организме повышенных концентраций определенных метаболитов. В этих случаях в диагностике заболеваний широко используют биохимические методы, позволяющие выявлять продукты нарушенного метаболизма.
Ранняя диагностика таких заболеваний обычно позволяет своевременно начать их патогенетическое лечение (проводить ту или иную коррекцию развивающегося патологического фенотипа). Поэтому уделяется большое внимание разработке «просеивающих» программ, или программ скрининга (от англ, screen - просеивать, сортировать), задачей которых является выявление наследственной патологии при массовом обследовании новорожденных с помощью тех или иных биохимических тестов. Биохимические методы можно применять и при проведении дородовой диагностики заболеваний.
Программа скрининга, как правило, осуществляется в два этапа. На первом этапе (массовый скрининг) проводят исследование больших контингентов детей (в роддомах, детских лечебно-профилактических учреждениях) с использованием относительно простых тестов. На втором этапе (селективный скрининг) уточняют диагноз и характер развития патологии у больных детей, выявленных при массовом обследовании, с помощью более сложных и точных биохимических методов исследования (электрофорез, хроматография, спектрофотометрия, спектроскопия и др.).
Примером успешного использования скринирующей программы могут служить исследования по выявлению детей с фенилкетонурией, проводившиеся в ряде стран. Как известно, в основе этого заболевания лежит блокирование основного биохимического этапа превращения фенилаланина в тирозин. При этом в организме накапливается фенилаланин, и на первое место выступает второстепенный путь его обмена, приводящий к образованию фенилпирувата. Последний не подвергается дальнейшим превращениям, накапливается в крови и тканях ребенка (в основном в форме фенилпировиноградной кислоты), вызывая хроническую интоксикацию организма (прежде всего головного мозга), и выделяется с мочой.
Широкое использование разработанных скрининг-тестов (теста Гатри, пробы с 2,4-динитрофенилгидразином, пробы Феллинга) при массовой диагностике фенилкетонурии позволили, например, в США из 28 млн обследованных новорожденных выявить 2000 больных индивидуумов. В этих случаях удалось избежать развития тяжелых проявлений заболевания путем раннего перевода таких детей на специальную диету с резким ограничением потребления фенилаланина.
Поскольку в крови больных фенилкетонурией повышается концентрация аминокислоты фенилаланина, которая выводится из организма с мочой, в диагностике заболевания практическое применение получил тест Гатри, основанный на использовании мутантных бактерий, неспособных расти на искусственной питательной среде без добавления этой аминокислоты. В указанном тесте стандартные диски фильтровальной бумаги, смоченные каплей крови (либо мочи) исследуемого ребенка, после их высушивания наносят на поверхность плотной диагностической среды в чашке Петри, предварительно засеянной соответствующими бактериями. На основании размеров зоны роста бактерий вокруг диска определяют концентрацию фенилаланина в исследуемом материале. Метод удобен и тем, что фильтровальные диски, смоченные мочой или кровью ребенка, можно пересылать по почте в специализированные лаборатории, в которых проводятся соответствующие биохимические исследования. Для уточнения диагноза в дальнейшем используют методы хроматографии и электрофореза, позволяющие определить аминокислотный состав мочи и сыворотки крови больного.
Ниже приводится краткая информация о некоторых биохимических скрининг-тестах, применяемых при массовой диагностике отдельных наследственных заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ. Для исследования используют кровь, мочу, культивирующиеся клетки и другой материал, полученный от того или иного индивидуума.
Проба Феллинга для диагностики фенилкетонурии. К 2 мл свежей мочи добавляют шесть капель 10%-го раствора хлористого железа и уксусной кислоты, вступающих в реакцию с фенилпировиноградной кислотой. Появление сине-зеленой или серо-зеленой окраски свидетельствует о положительном результате пробы, что соответствует уровню фенилаланина в крови порядка 900-1200 мкМоль/л (норма до 120 мкМоль/л или 2 мг%).
Проба с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФГ) на наличие фе- нилпировиноградной кислоты. К 2 мл мочи добавляют такое же количество 0,3%-го раствора 2,4-ДНФГ. Вначале смесь прозрачна. Если в пробе имеется фенилпировиноградная кислота, то в течение 1-3 мин она приобретает ярко-желтый мутный оттенок, который сохраняется в течение суток. Применяется для диагностики фенилкетонурии.
Проба на цистин и гомоцистин. К пяти каплям мочи добавляют каплю концентрированного раствора аммиака и две капли раствора цианида натрия (2 г цианида натрия, 5 мл воды и 95 мл 96%-го этанола). Через несколько минут добавляют несколько капель 5%-го раствора нитропруссида натрия. Реакция считается положительной при появлении темно-красной окраски. Проба используется для диагностики цистинурии (повышенного содержания в моче аминокислоты цистина) и гомоцистинурии (наличия в моче гомоцистина).
Иод-азидная проба на цистин для диагностики цистинурии и гомоцистинурии. Используемый реактив: 1,5 г азида натрия растворяют в 50 мл 0,1%-го раствора йода; полученный раствор разводят в 50 мл 95%-го этанола и хранят в темном сосуде при комнатной температуре. К моче, высушенной на фильтровальной бумаге, добавляют одну каплю реактива и в течение 5 мин наблюдают за выцветанием темно-коричневой окраски. Если выцветание происходит в течение этого времени, то в образце содержится цистин или гомоцистин в повышенных концентрациях.
Тест Миллона (на тирозин). Используемый реактив: 10 г металлической ртути растворяют в 11 мл концентрированной азотной кислоты, полученный раствор медленно вливают в 29 мл дистиллированной воды. На фильтровальную бумагу, смоченную мочой обследуемого индивидуума, наносят одну каплю реактива Миллона. Появление красно-оранжевой окраски свидетельствует о положительной пробе. С помощью этого теста выявляют повышенное содержание тирозина в моче (тирозинурию) при нарушениях метаболизма этой аминокислоты, приводящих к увеличению ее концентрации в плазме крови (тирози- немии).
Проба на галактозу и лактозу. К 1 мл мочи добавляют 0,5 мл концентрированного раствора аммиака и три капли 10%-го раствора NaOH. Пробу нагревают до кипения, при появлении ярко-желтой окраски она считается положительной. Используется при диагностике галактоземии.
Проба Селиванова на фруктозу. Несколько кристаллов резорцина растворяют в 3 мл концентрированной соляной кислоты. К одному объему полученного реактива добавляют два объема мочи, смесь подогревают на водяной бане. При наличии фруктозы наблюдается интенсивное красное окрашивание. Пробу проводят для обнаружения фруктозурии при повышенном содержании этого углевода в крови больного (фруктоземии).
Проба Саржа на фруктозу. На два кристалла КОН наносят две капли мочи, при наличии в ней фруктозы появляется красное окрашивание. Пробу используют для диагностики фруктозурии.
Проба Алъгаузена на глюкозу. К 4 мл мочи добавляют 1 мл 10%-го раствора NaOH, кипятят 1 мин. Через 10 мин сравнивают результат со стандартной шкалой. При положительной пробе - окраска от желтой до интенсивной красно-коричневой. Проводят для выявления глюкозурии.
Проба с цетилтриметиламмония бромидом (ЦТАБ ) на гликозами- ногликаны (мукополисахариды ). Используемый реактив: 2,5%-ный раствор ЦТАБ в 1М цитратном буфере; pH 5,75. К 5 мл мочи добавляют 1 мл реактива. При положительном результате в течение 30 мин наблюдают образование хлопьевидного осадка. Такой результат можно получить при обследовании лиц с синдромами Марфана, Гурлера, Хантера, а также в случае ревматоидного артрита и некоторых других заболеваний.
Тест с толуидиновым синим на мукополисахариды. Используют реактив: 0,04%-ный раствор толуидинового синего в 0,2%-ной уксусной кислоте. Одну каплю мочи наносят на фильтровальную бумагу, высушивают при комнатной температуре, погружают в реактив на 1 мин, после чего отмывают в 95%-ном этаноле. Толуидиновый синий реагирует с кислыми гликозаминогликанами как катионовый краситель, давая стойкое пурпурное кольцо на голубом фоне.
Проба на порфирию. Пробу проводят с мочой или фекалиями, к которым добавляют реактив, содержащий амиловый спирт, ледяную уксусную кислоту и эфир в равных количествах. Появление бриллиантово-розовой флюоресценции при освещении ультрафиолетом свидетельствует о наличии порфирина.
ЗАДАНИЯ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЫ
- 1. Укажите, при каких из приведенных заболеваний возможно проведение массового скрининга с использованием биохимических тестов:
- а) фенилкетонурия;
- б) болезнь Дауна;
- в) трисомия X;
- г) галактоземия;
- д) тирозинемия.
- 2. Перечислите методы диагностики, применяемые при подозрении на следующие заболевания: галактоземию, фенилкетонурию, болезнь Дауна, фруктоземию.
С помощью биохимических методов изучают наследственные заболевания, обусловленные генными мутациями, и полиформизм по нормальным первичным продуктам генов. Впервые эти методы генетики человека стали применять в начале ХХ в. В последнее время их широко используют в поиске новых форм мутантных аллелей. С их помощью описано более 1000 врожденных болезней обмена веществ. Для многих из них выявлен дефект первичного генного продукта.
Биохимическую диагностику наследственных нарушений обмена проводят в 2 этапа. На первом этапе отбирают предположительные случаи заболеваний, на втором – более сложными и точными методами уточняют диагноз заболевания. Применение биохимических исследований для диагностики заболеваний в пренатальном периоде или непосредственно после рождения позволяет своевременно выявить патологию и начать специфические медицинские мероприятия.
Транскрипционые факторы - белки, взаимодействующие с определёнными регуляторными сайтами и ускоряющие или замедляющие процесс транскрипции. Соотношение информативной и неинформативной частей в транскриптонах эукариотов составляет в среднем 1:9 (у прокариотов 9:1).Соседние транскриптоны могут быть отделены друг от друга нетранскрибируемыми участками ДНК. Разделение ДНК на множество транскриптонов позволяет осуществлять с разной активностью индивидуальное считывание (транскрипцию) разных генов.
В каждом транскриптоне транскрибируется только одна из двух цепей ДНК, которая называется матричной, вторая, комплементарная ей цепь, называется кодирующей. Синтез цепи РНК идёт от 5"- к З"-концу, при этом матричная цепь ДНК всегда антипараллельна синтезируемой нуклеиновой кислоте
Посттранскрипционные модификации первичноготранскриптатРНК (процессинг тРНК)
ПервичныйтранскрипттРНК содержит около 100 нуклеотидов, а после процессинга - 70-90 нуклеотидньгх остатков. Посттранскрипционные модификации первичныхтранскриптовтРНК происходят при участии РНК-аз (рибонуклеаз). Так, формирование 3"-конца тРНК катализирует РНК-аза, представляющая собой 3"-экзонуклеазу, "отрезающую" по одному нук-леотиду, пока не достигнет последовательности -ССА, одинаковой для всех тРНК. Для некоторых тРНК формирование последовательности -ССА на 3"-конце (акцепторный конец) происходит в результате последовательного присоединения этих трёх нуклеотидов. Пре-тРНК содержит всего один интрон, состоящий из 14-16 нуклеотидов. Удаление интрона и сплайсинг приводят к формированию структуры, называемой "антикодон", - триплета нуклеотидов, обеспечивающего взаимодействие тРНК с комплементарным кодоном мРНК в ходе синтеза белков
Посттранскрипционные модификации (процессинг) первичноготранскриптарРНК. Формирование рибосом
В клетках человека содержится около сотни копий гена рРНК, локализованных группами на пяти хромосомах. Гены рРНК транскрибируются РНК-полимеразой I с образованием идентичныхтранскриптов. Первичныетранскрипты имеют длину около 13 000 нуклеотид-ных остатков (45S рРНК). Прежде чем покинуть ядро в составе рибосомной частицы, молекула 45 S рРНК подвергается процессин-гу, в результате образуется 28S рРНК (около 5000 нуклеотидов), 18S рРНК (около 2000 нуклеотидов) и 5,88 рРНК (около 160 нуклеотидов), которые являются компонентами рибосом (рис. 4-35). Остальная часть транскрипта разрушается в ядре.
Генеалогический метод генетики человека. Основные правила составления и последующего анализа родословных схем (на примере собственной семейной родословной схеме). Значение метода в изучении закономерностей наследования признаков.
Методы генетики человека
Для генетических исследований человек является неудобным объектом, так как у человека: невозможно экспериментальное скрещивание; большое количество хромосом; поздно наступает половая зрелость; малое число потомков в каждой семье; невозможно уравнивание условий жизни для потомства.
В генетике человека используется ряд методов исследования.
Генеалогический метод
Использование этого метода возможно в том случае, когда известны прямые родственники - предки обладателя наследственного признака (пробанда) по материнской и отцовской линиям в ряду поколений или потомки пробанда также в нескольких поколениях. При составлении родословных в генетике используется определенная система обозначений. После составления родословной проводится ее анализ с целью установления характера наследования изучаемого признака.
Условные обозначения, принятые при составлении родословных:
1 - мужчина; 2 - женщина; 3 - пол не выяснен; 4 - обладатель изучаемого признака; 5 - гетерозиготный носитель изучаемого рецессивного гена; 6 - брак; 7 - брак мужчины с двумя женщинами; 8 - родственный брак; 9 - родители, дети и порядок их рождения; 10 - дизиготные близнецы; 11 - монозиготные близнецы.
Благодаря генеалогическому методу были определены типы наследования многих признаков у человека. Так, по аутосомно-доминантному типу наследуются полидактилия (увеличенное количество пальцев), возможность свертывать язык в трубочку, брахидактилия (короткопалость, обусловленная отсутствием двух фаланг на пальцах), веснушки, раннее облысение, сросшиеся пальцы, заячья губа, волчья пасть, катаракта глаз, хрупкость костей и многие другие. Альбинизм, рыжие волосы, подверженность полиомиелиту, сахарный диабет, врожденная глухота и другие признаки наследуются как аутосомно-рецессивные.
Целый ряд признаков наследуется сцепленно с полом: Х-сцепленное наследование - гемофилия, дальтонизм; Y-сцепленное - гипертрихоз края ушной раковины, перепончатость пальцев ног. Имеется ряд генов, локализованных в гомологичных участках Х- и Y-хромосом, например общая цветовая слепота.
метод анализа родословных, является наиболее фундаментальным и универсальным методом изучения наследственности и изменчивости человека. Он заключается в изучении какого-либо нормального или чаще патологического признака в поколениях людей, которые находятся друг с другом в родственных отношениях. Генеалогический метод опирается на генеалогию – учение о родословных. Сутью генеалогического метода является составление и анализ родословных. Генеалогический метод соответствует основному методу генетики - гибридологическому методу, который был впервые разработан Г. Менделем. Но в отличие от него исследователи не подбирают родительские пары для целенаправленного скрещивания, а лишь детально анализируют результаты процесса естественной репродукции людей. Анализу по изучаемому признаку подвергается одна или несколько десятков семей с многочисленными родственниками разных поколений. Использование большого количества семей отчасти компенсирует низкую плодовитость человека и увеличивает число изучаемых потомков.
Похожая информация.
Биохимические показатели (первичный белковый продукт гена, накопление патологических метаболитов внутри клетки и во внеклеточных жидкостях) лучше отражают сущность болезни, чем клинические симптомы, не только в диагностическом, но и в генетическом аспекте. Значимость биохимических методов повышалась по мере их совершенствования (электрофорез, хроматография, спектроскопия и др.) и описания наследственных болезней. В 80-х годах ХХ в. был выделен целый раздел - наследственные болезни обмена веществ, т.е. заболевания с различными биохимическими нарушениями.
Биохимические методы направлены на определение биохимического фенотипа организма. Уровни, на которых оценивают фенотип, могут быть разными - от первичного продукта гена (полипептидной цепи) до конечных метаболитов в крови, моче или поте. Биохимические методы чрезвычайно многообразны, и их значение в диагностике наследственных болезней постоянно возрастает. Разработка молекулярно-генетических методов диагностики частично снизила интерес к биохимическим исследованиям, но вскоре стало ясно, что в большинстве случаев указанные методы дополняют друг друга, поскольку молекулярногенетически описывают генотип, а биохимически - фенотип.
Болезнь в конечном счете - фенотип. В связи с этим, несмотря на сложность, а иногда и дороговизну биохимических методов, им принадлежит существенная роль в диагностике моногенных наследственных заболеваний. Современные высокоточные технологии (высокоэффективная жидкостная хроматография, хромато-масс-спектрометрия, газовая хроматография, тандемная спектрометрия) позволяют идентифицировать любые метаболиты, специфичные для конкретной наследственной болезни.
На первый взгляд может показаться, что самый точный метод диагностики - определение мутации на уровне ДНК. Тем не менее это не всегда так. Реализация действия гена - сложный процесс, поэтому нормальная структура гена, а точнее - отсутствие мутации, не всегда служит полной гарантией нормального биохимического фенотипа.
Принципы биохимической диагностики наследственных болезней менялись в процессе развития генетики человека и биохимии. Так, до 50-х годов XX в. диагностика была направлена на поиски специфичных для каждого заболевания метаболитов в моче (алкаптонурия, фенилкетонурия).
С 50-х до 70-х годов упор в диагностике был сделан на обнаружение энзимопатий. Разумеется, поиски метаболитов в конечных реакциях при этом не исключались. Наконец, с 70-х годов главным объектом диагностики стали белки разных групп. К настоящему времени все они служат предметом биохимической диагностики.
Оценка метаболитов в биологических жидкостях - необходимый этап диагностики аминоацидопатий, органических ацидурий, мукополисахаридозов, митохондриальных и пероксисомных болезней, дефектов метаболизма пуринов и пиримидинов и др. Для этих целей используют методы качественного химического анализа, спектрофотометрические способы количественной оценки соединений, а также различные виды хроматографии.
Хроматографические методы анализа играют важнейшую роль в диагностике наследственных болезней обмена (НБО). Это обусловлено тем, что современный арсенал хроматографических технологий чрезвычайно широк и позволяет эффективно и информативно разделять сложные многокомпонентные смеси, к которым в том числе относят и биологический материал.
Для количественного анализа маркеров-метаболитов НБО успешно применяют такие хроматографические методы, как газовая и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), а также хромато-масс-спектрометрия (ХМС). Газовая хроматография и ВЭЖХ - универсальные методы разделения сложных смесей соединений, отличающиеся высокой чувствительностью и воспроизводимостью. В обоих случаях разделение осуществляют в результате различного взаимодействия компонентов смеси с неподвижной и подвижной фазами хроматографической колонки. Для газовой хроматографии подвижной фазой служит газ-носитель, для ВЭЖХ - жидкость (элюент). Выход каждого соединения фиксирует детектор прибора, сигнал которого преобразуется в пики на хроматограмме. Каждый пик характеризуется временем удерживания и площадью. Следует отметить, что газовую хроматографию проводят, как правило, при высокотемпературном режиме, поэтому ограничением для ее применения считают термическую неустойчивость соединений. Для ВЭЖХ не существует подобных ограничений, так как в этом случае анализ проводят в мягких условиях.
Масс-спектрометрия - аналитический метод, с помощью которого можно получать как качественную (структура), так и количественную (молекулярная масса или концентрация) информацию об анализируемых молекулах после их преобразования в ионы.
Существенное отличие масс-спектрометрии от других физико-химических аналитических методов состоит в том, что в масс-спектрометре определяют непосредственно массу молекул и их фрагментов. Результаты представляют графически (так называемый масс-спектр). Иногда невозможно анализировать сложные многокомпонентные смеси молекул без их предварительного разделения. Это можно сделать либо хроматографически (жидкостная или газовая хроматография), либо использовать два последовательно соединенных массспектрометра (тандемная масс-спектрометрия - ТМС). ТМС позволяет охарактеризовать структуру, молекулярную массу и провести количественную оценку 3000 соединений одновременно. При этом для проведения анализа длительная подготовка проб не требуется (как, например, для газовой хроматографии), а время исследования занимает несколько секунд.
ТМС - одно из перспективных направлений в развитии программ диагностики НБО, поскольку позволяет количественно и в микроколичествах биологического материала определять множество метаболитов. В настоящее время в некоторых странах ТМС применяют для массового скрининга новорожденных на наследственные болезни.
В связи с многообразием биохимических методов, применяемых в лабораторной диагностике наследственных болезней, в их использовании должна быть определенная система. У пробанда или члена его семьи нереально исключить все наследственные болезни, которые могут попасть в поле зрения при обследовании пациента. Если применять максимально возможное число методов диагностики, то каждое обследование станет очень трудоемким и долгим. Исходную схему обследования строят на клинической картине болезни, генеалогических сведениях и биохимической стратегии, которые позволяют определить ход обследования на основе поэтапного исключения определенных классов наследственных болезней обмена (просеивающий метод).
Необходимо подчеркнуть, что, в отличие от цитогенетических и молекулярногенетических исследований, биохимические методы многоступенчаты. Для их проведения требуется аппаратура разных классов. Материалом для биохимической диагностики могут быть моча, пот, плазма и сыворотка крови, форменные элементы крови, культуры клеток (фибробласты, лимфоциты) и биоптаты мышц. При использовании просеивающего метода в биохимической диагностике можно выделить два уровня: первичный и уточняющий. Каждый из них может быть по-разному «нагружен» реакциями в зависимости от возможностей лаборатории.
Основная цель первичной диагностики заключается в том, чтобы обнаружить здоровых людей и отобрать пациентов для последующего уточнения диагноза. В программах первичной диагностики в качестве материала используют мочу и небольшое количество крови. Программы могут быть массовыми и селективными.
Селективные диагностические программы предусматривают проверку биохимических аномалий обмена (моча, кровь) у пациентов с подозрением на генные наследственные болезни. Фактически они должны функционировать в каждой большой больнице. Показания для их применения достаточно широкие, а стоимость каждого анализа невысока.
В селективных программах можно использовать простые качественные реакции (например, тест с хлоридом железа для диагностики фенилкетонурии или с динитрофенилгидразином для обнаружения кетокислот) или более точные методы, позволяющие обнаруживать большие группы отклонений. Газовую хроматографию применяют для диагностики НБО органических кислот и ряда аминоацидопатий. С помощью электрофореза гемоглобинов диагностируют заболевания из группы гемоглобинопатий.
Нередко приходится углублять биохимический анализ от количественного определения метаболита до измерения активности фермента (использование нативных тканей или культивированных клеток), например, с помощью спектрофлюориметрии или спектрометрии (в зависимости от применяемого субстрата). Следует отметить, что определение активности ферментов при наследственных заболеваниях - не рутинная процедура, проводимая только в специализированных лабораториях. В современных условиях очень многие этапы биохимической диагностики выполняют автоматически, в частности с помощью аминоанализаторов.
Селективные диагностические программы обеспечивают только предположительное обнаружение больных с НБО. Методы подтверждающей диагностики включают количественное определение метаболитов, исследование их кинетики, энзимо- и ДНК-диагностику.
Показания для применения биохимических методов диагностики у новорожденных: нарушения сознания, судороги, нарушения ритма дыхания, мышечная гипотония, нарушения вскармливания, желтуха, специфический запах мочи и пота, метаболический ацидоз с дефицитом оснований и гипогликемия. У детей более старшего возраста биохимические методы используют во всех случаях подозрения на НБО (задержка физического и умственного развития, потеря приобретенных функций, увеличение размеров внутренних органов), а также при клинической картине, специфичной для определенного заболевания.
Биохимические методы применяют для диагностики наследственных болезней и гетерозиготных состояний у взрослых (гепатолентикулярная дегенерация, недостаточность α1-антитрипсина, недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и др.). При диагностике многих болезней биохимические методы заменяют молекулярно-генетическими в связи с их большей точностью или экономичностью. Принципиально важным считают правильное сочетание тех и других методов.
БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА, методы количественного определения неорганических и органических веществ, основанные на использовании процессов с участием биологических компонентов (ферментов, антител и др.). Аналитический сигнал - конечную концентрацию одного из продуктов реакции либо начальную скорость процесса, положенного в основу методики определения, регистрируют главным образом спектрофотометрическими, люминесцентными, электрохимическими методами. Наиболее распространены ферментативные и иммунохимические биохимические методы анализа.
В ферментативных методах используют зависимость скорости химической реакции, катализируемой ферментом, от концентраций реагирующих веществ и фермента. Достоинства ферментативных биохимических методов анализа: высокая чувствительность, селективность, экспрессность и мягкие условия (25-37 °С, pH 5-10) проведения анализа. Предел обнаружения, нижняя и верхняя границы определяемых содержаний компонентов зависят от кинетических характеристик используемой индикаторной ферментативной реакции и, главным образом, каталитической активности фермента, от способа детектирования аналитического сигнала. Высокая селективность ферментативных биохимических методов анализа обусловлена образованием фермент-субстратного комплекса, требующим структурного соответствия субстрата активному центру фермента. С помощью ферментативных биохимических методов анализа определяют ферменты, субстраты, кофакторы и коферменты, активаторы и ингибиторы ферментов. Известны многочисленные высокочувствительные (нижние границы определяемых содержаний 10 -9 -10 -6 моль/дм 3) и селективные ферментативные биохимические методы анализа определения ионов металлов, неорганических анионов, пестицидов, фенолов, аминокислот, метаболитов, мутагенов, канцерогенов и других биологически активных соединений. Для создания биосенсоров, ферментных реакторов, разработки простых и экспрессных тест-методов определения токсикантов используют иммобилизованные ферменты. Высокая стабильность, возможность многократного использования иммобилизованных ферментов повышают экономичность, экспрессность анализа, позволяют его автоматизировать. Ферментативные биохимические методы анализа применяют в анализе объектов медицины (биологических жидкостей, тканей живых организмов), окружающей среды (природных и сточных вод, почв, воздуха, тканей растений), пищевых продуктов, фармацевтических препаратов, для непрерывного контроля микробиологических и биохимических процессов.
Иммунохимические методы основаны на специфическом связывании определяемого соединения - антигена - соответствующими антителами. Малые концентрации комплекса антиген - антитело определяют, вводя в один из компонентов системы метку, детектируемую соответствующим инструментальным методом. Детектируемый сигнал пропорционален концентрации антигена. Используют изотопные, флуоресцентные, парамагнитные, ферментные метки. Анализ с использованием ферментной метки - иммуноферментный анализ - сочетает высокую чувствительность определения метки (предел обнаружения менее 10 -12 моль/дм 3) с уникальной специфичностью иммунохимического анализа. Иммунохимические биохимические методы анализа применяют для определения белков, пестицидов, гормонов, стероидов, наркотических и лекарственных средств, вирусов и клеток. Достоинства иммунохимического биохимического метода анализа: высокая чувствительность и специфичность определения, возможность использования малых объёмов анализируемой пробы (5-50 мкл). Время анализа - несколько минут. Разработаны диагностические иммуноферментные тест-системы для экспресс-определения биологически активных соединений в медицине, ветеринарии, микробиологической, фармакологической, пищевой промышленности, сельском хозяйстве, в объектах окружающей среды.
Лит.: Долманова И. Ф., Угарова Н. Н. Ферментативные методы анализа // Журнал аналитической химии. 1980. Т. 35. Вып. 8; Кулис Ю. Ю. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов. Вильнюс, 1981: Теория и практика иммуноферментного анализа. М., 1991.
Биохимический метод используется для диагностики наследственных болезней обмена. Методы биохимической генетики имеют несколько уровней.
Первый этап предполагает обследование с помощью недорогих качественных ориентировочных экспресс-методик, так называемых скрининговых качественных и полуколичественных реакций с мочой и кровью, позволяющих заподозрить то или иное заболевание.
На втором этапе обследование проводят с помощью сложных и дорогих количественных методов для установления точного диагноза наследственного заболевания. При этом осуществляется количественное определение в крови аминокислот, белков-ферментов и др.
Третий этап включает в себя определение дефектного гена методами молекулярной диагностики.
Медико-генетическое консультирование - специализированный вид медицинской помощи населению направленный на профилактику наследственных болезней. Суть его в определении прогноза рождения ребенка с наследственной патологией, объяснении вероятности этого события и помощи консультирующейся семье в принятии решения о деторождении.
Медико-генетическая консультация состоит из трех этапов: диагностика, прогнозирование и заключение. Как правило, за консультацией обращаются семьи, где уже имеется ребенок с наследственной патологией, или семьи, в которых имеются больные родственники. Консультирование всегда начинается с уточнения диагноза наследственной болезни, поскольку точный диагноз является необходимой предпосылкой любой консультации. Уточнение диагноза в медико-генетической консультации проводится с помощью генетического анализа. При этом во всех без исключения случаях применяется генеалогический метод исследования.
На втором этапе определяют прогноз для потомства. Генетический риск может быть определен либо путем теоретических расчетов с использованием методов генетического анализа и вариационной статистики, либо с помощью эмпирических данных (на основе таблиц эмпирического риска). При моногенных, менделирующих болезнях прогноз основывается на расчете вероятности появления потомства в соответствии с генетическими закономерностями. При этом если известен тип наследования данного заболевания и по родословной удается установить генотип родителей, оценка риска сводится к анализу менделевского расщепления. Третий этап консультирования включает представление заключения и советы родителям. Заключительные этапы консультирования требуют самого пристального внимания. Нельзя получить правильный эффект консультирования, если пациенты неправильно поймут объяснения врача-генетика. Для достижения цели консультирования при беседе с пациентами следует учитывать уровень их образования, социально-экономическое положение семьи, структуру личности и взаимоотношения в семье.
Пренатальная диагностика - дородовая диагностика, с целью обнаружения патологии на стадии внутриутробного развития. Позволяет обнаружить более 90 % плодов с синдромом Дауна (трисомия 21); трисомии 18 (известной как синдром Эдвардса) около 97 %, более 40 % нарушений развития сердца и др. В случае наличия у плода болезни родители при помощи врача-консультанта тщательно взвешивают возможности современной медицины и свои собственные в плане реабилитации ребенка. В результате семья принимает решение о судьбе данного ребенка и решает вопрос о продолжении вынашивания или о прерывании беременности.
К пренатальной диагностике относится и определение отцовства на ранних сроках беременности, а также определение пола ребенка.
- В медицине под скринингом понимают проведение простых и безопасных исследований больших групп населения с целью выделения групп риска развития той или иной патологии. По охвату населения:
- массовый
- селективный
- По категории населения:
- пренатальный
- неонатальный
- По сроку гестации:
- первого триместра
- второго триместра
- По методу:
- ультразвуковой
- эндоскопический
- цитологический
- биохимический
- комбинированный
- аудиологический
Доклиническая или начальная клиническая стадия болезни чаще всего отличается минимально выраженными субъективными и объективными признаками того или иного заболевания. Выявление заболевания на данной стадии обозначает возможность его профилактики или благоприятного течения, благодаря комплексу тех или иных мероприятий. Но врачу, анализирующему результаты диспансеризации, проводимой по «старым» методическим схемам, сложно ориентироваться, трудно принимать решение и предвидеть пути дальнейшего развития той или иной патологии. Особенно это имеет отношение к трудоспособной части населения, не имеющей ранее установленных диагнозов или впервые обратившихся к врачу. Именно поэтому не всегда оправдано использование многих лабораторных и инструментальных исследований, а также консультаций специалистов на этапе первого контакта с пациентом. Во-первых, не всем больным показан весь спектр диспансерных исследований. Во-вторых, время принятия диагностического и терапевтического решения в классическом варианте обследования больного достаточно продолжительно. Более того, нередко возникают неточные диагностические гипотезы, например, о т.н. функциональных заболеваниях, которые затем на продолжительный период времени остаются за границами действенных терапевтических или профилактических мероприятий. Основная задача диспансеризации заключается в срочном распознавании болезней и угрожающих состояний и в выборе тактических решений по их устранению или снижению риска для жизни. Благодаря диспансеризации, может быть обеспечена первичная профилактика многих заболеваний, их превентивная терапия, или же лечение заболеваний в начальной стадии, когда оно наиболее эффективно. Напротив, именно из-за поздней диагностики результаты лечения в ряде случаев неудовлетворительны. Таким образом, идеалом диспансеризации могла бы стать такая система, которая могла бы обеспечить не только диагностику (прогноз) заболеваний на ранней (доклинической) стадии развития, но и принятие правильного решения.
популяция - это группа особей определенного вида, которая: 1) в течение достаточно длительного времени (большого числа поколений) населяет конкретный ареал; 2) в той или иной степени случайно скрещивается в его пределах; 3) не имеет внутри себя заметных изоляционных барьеров; отделена от соседних групп этого вида той или иной степенью давления тех или иных форм изоляции. Генетически популяции характеризуются:
- Генофондом - совокупностью всех генов всех членов популяции
- Генетическим единством, обусловленным панмиксией.
- Наследственным разнообразием генофонда - генетической гетерогенностью генофонда, обусловленной мутационным процессом, потоком генов (миграцией), рекомбинацией.
Между популяциями одного вида существует постоянный обмен генами, осуществляющийся за счет миграций отдельных особей и обеспечивающий сохранение единства генофонда вида. Таким образом, ценные приспособительные варианты, возникшие и размножившиеся в одной локальной популяции, постепенно распространяются в пределах всего вида. Еще одним важным фактором повышения изменчивости в популяции является процесс рекомбинации.
Процесс эволюции основывается на двух главных явлениях: изменчивости и изменении частот генов и генотипов, что составляет сущность элементарного эволюционного события.
К изменению частот аллелей и генотипов в популяции приводит отбор, однако оно возможно и в результате мутаций, миграции особей, случайного дрейфа генов, изоляции, а также избирательного, или ассортативного, скрещивания. Все эти факторы, действующие в популяциях, называют факторами динамики популяций.
Потоком генов называют изменение генетического состава популяции, возникшее вследствие поступления в популяцию новых генов в результате миграции или контактов с представителями других популяций (Маккьюсик, 1967; Мала, Кайгер, 1988). Если популяции имеют разные частоты аллелей, то миграция может приводить к изменению частот аллелей, привносимых особями-иммигрантами.
Непосредственные результаты такого события связаны с последствиями возникновения мутаций, однако миграция изменяет частоты аллелей значительно быстрее, чем мутации. Влияние потока генов на динамику популяций тех или иных организмов зависит от времени достижения половозрелости и скорости размножения, а также расстояния между локальными популяциями.
Внутри многочисленных популяций собак и кошек земного шара, благодаря скрещиваниям происходит свободный обмен генами. С другой стороны, огромное значение для генофонда популяций имеют миграции. Этот процесс идет в разных направлениях: во-первых, широко мигрируют по городам и странам владельцы собак и кошек, перевозящие с собой своих любимцев; во-вторых, идет интенсивный завоз щенков, котят и взрослых животных с целью улучшения местного поголовья владельцами питомников и руководителями кинологических и фелинологических объединений.
Из каких-то стран или городов завозятся единичные особи, вклад которых в популяцию может быть совсем небольшим. Из других вывоз племенного поголовья носит массовый характер, соответственно широким потоком вливаются в генофонд местных популяций их гены.
Закон Харди-Вайнберга - это закон популяционной генетики - в популяции бесконечно большого размера, в которой не действует отбор, не идет мутационный процесс, отсутствует обмен особями с другими популяциями, не происходит дрейф генов, все скрещивания случайны - частоты генотипов по какому-либо гену (в случае если в популяции есть два аллеля этого гена) будут поддерживаться постоянными из поколения в поколение и соответствовать уравнению:
p² + 2pq + q² = 1
Где p² - доля гомозигот по одному из аллелей; p - частота этого аллеля; q² - доля гомозигот по альтернативному аллелю; q - частота соответствующего аллеля; 2pq - доля гетерозигот.
Закон действует в идеальных популяциях, состоящих из бесконечного числа особей, полностью панмиктических и на которых не действуют факторы отбора.
Генетический полиморфизм , сосуществование в пределах популяции двух или нескольких различных наследственных форм, находящихся в динамическом равновесии в течение нескольких и даже многих поколений. Чаще всего Генетический полиморфизм обусловливается либо варьирующими давлениями и векторами (направленностью) отбора в различных условиях (например, в разные сезоны), либо повышенной относительной жизнеспособностью гетерозигот . Один из видов Генетический полиморфизм - сбалансированный Генетический полиморфизм - характеризуется постоянным оптимальным соотношением полиморфных форм, отклонение от которого оказывается неблагоприятным для вида, и автоматически регулируется (устанавливается оптимальное соотношение форм). В состоянии сбалансированного Генетический полиморфизм у человека и животных находится большинство генов. Различают несколько форм Генетический полиморфизм , анализ которых позволяет определять действие отбора в природных популяциях.
«Генетический груз » - термин, чаще всего используемый для обозначения суммы неблагоприятных летальных и сублетальных мутаций в генофонде популяции. Концепция была предложена английским популяционным генетиком Джоном Холдейном (1937) Генетический груз - накопление летальных и сублетальных отрицательных мутаций, вызывающих при переходе в гомозиготное состояние выраженное снижение жизнеспособности особей, или их гибель.
«Вырождение» - наблюдаемое при близкородственном скрещивании ухудшение фенотипических характеристик потомства.
В более строгом смысле генетический груз в популяционной генетике - это выражение уменьшения селективной ценности для популяции по сравнению с той, которую имела бы популяция, если бы все индивидуальные организмы соответствовали бы наиболее благоприятному генотипу. Обычно выражается в средней приспособленности по сравнению с максимальной приспособленностью.
Частью генетического груза является мутационный груз.
Генетический груз рассматривается, как мера неприспособленности популяции к условиям окружающей среды. Он оценивается по различию приспособленности реальной популяции - по отношению к приспособленности воображаемой, максимально приспособленной популяции.
