Персистенция От лат. persisto - постоянно пребывать, оставаться, длительное существование, присутствие длительное пребывание инфекта в организме животных и человека либо без клинических патологических проявлений (латентное течение, ремиссия инфекционного процесса), либо способных при определенных условиях (иммунный дисбаланс и иммунная недостаточность различной этиологии - стресс, переохлаждение, интеркуррентная инфекция, обстрение хронического заболевания и т. д.) к активации с исходом в заболевание (активное течение, обострение инфекционного процесса).
Механизмы персистенции: - Образование L-форм Антигенная мимикрия Иммуноглобулиновый покров Способность секретировать вещества, препятствующие действию иммунных факторов Сорбция белков хозяина на поверхности клетки и экранирование от иммунной системы хозяина Антифагоцитарные факторы: Капсулы Микрокапсулы Слизистые чехлы Вещества снижающие хемотаксис Незавершенный фагоцитоз и др
Действие бактерий на цитокины: Действие Разрушают цитокины Бактерии Н. aeruginosa с помощью ферментов L. pneumophila Связывают цитокины Е. coli Подавляют синтез Цитокинов Цитокины ИЛ-2, ФНОа, ИФ-у ИЛ-2 ИЛ-1, ИЛ-2, ФНОа, ГМКСФ S. typhimurium, S. flexneri ФНОа M. tuberculosis ТРФ(3 M. avium ИЛ-6 L. monocytogenes ИЛ-3, КСФ-1 E. coli ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИФ-у Y. enterocolitica, B. suis, V. ФНОа cholerae, B. anthracis P. aeruginosa ФНОа, ИЛ-1, ИФ-у S. typhimurium ИЛ-2
Антилизоцимная и антилактоферриновая активность: Микроорганизмы n Антилактоферриновая активность, Антилизоцимная нг/мл активность, мкг/мл M ± SD S. aureus S. haemolyticus S. epidermidis E. coli Klebsiella spp. 15 22, 72 ± 1, 88 10, 1 ± 2, 17* 16 20, 08 ± 1, 41 4, 40 ± 1, 12 15 11, 50 ± 1, 45* 9, 91 ± 0, 82* 16 22, 84 ± 1, 41 4, 19 ± 0, 61 12 7, 83 ± 1, 13* 8, 92 ± 2, 45* 15 5, 65 ± 0, 62 1, 24 ± 0, 25 12 23, 87 ± 0, 67* 2, 58 ± 0, 27* 12 18, 17 ± 3, 20 1, 64 ± 0, 15 12 19, 40 ± 2, 47 3, 24 ± 0, 27* 14 18, 13 ± 0, 64 1, 83 ± 0, 28 Больные ревматическими заболеваниями Контроль *Статистически достоверно
Образование L-формы - бактерии, частично или полностью лишённые клеточной стенки, но сохранившие способность к развитию. К возникновению L- форм приводит воздействие агентов, блокирующих выработку клеточной стенки: 1. антибиотики (пенициллины циклосерин, цефалоспорины, ванкомицин), 2. ферменты (лизоцим, амидаза, эндопептидаза), 3. ультрафиолетовые и рентгеновские лучи, 4. аминокислота глицин.
История вопроса: Буква L - первая буква названия Листеровского института в Лондоне, где впервые доктор наук Эмми Кляйнебергер-Нобель в 1935 году обратила внимание на развитие морфологически весьма необычных клеток в культуре бактерий Streptobacillus moniliformis, выделенной из жидкости уха крысы.
вакуоли L-форма Bacillus subtilis, масштаб - 500 нм. Многообразие L-форм Bacillus subtilis, при масштабе в 10 мкм.
L-формы Особенности L- форм: 1. Синтез полноценной клеточной стенки невозможен Возвращение в вегетативную форму при нормализации факторов окружающей среды Возвращение в вегетативную форму невозможно. Дальнейшее существование как у микоплазм Сходные культуральные свойства. 3. Постепенное превращение из грамположительных в грамотрицательные структуры. Образование стабильных и нестабильных Lформ. 5. Изменение антигенных свойств (утрата К- и Оантигенов). Приобретение способности к персистенции. 6. Снижение вирулентности в связи с утратой различных факторов патогенности (адгезии, инвазии, эндотоксина и т. п) стабильные Система генетического контроля синтеза клеточной стенки (пептидогликан) 2. 4. нестабильные Сходство морфологических изменений: образование нитевидных, волокнистых, колбасовидных, шаровидных и гранулярных форм.
Механизм фагоцитоза: Хемостаксис Силы физико-химического взаимодействия Градиент концентрации 2. Стадия адгезии Осонизация (АТ, С 3 b, фибронектин, сурфактан) Физико-химическое взаимодействие 3. Эндоцитоз 4. Микробоцидность Кислороднезависимая кислородзависимая
макроорганизм 1. Нарушение слияния фагосомы с лизосомой (микобактерии туберкулеза, простейшие, токсоплазмы) 2. Резистентность к лизосомальным ферментам (гонококки, стрептококки гр А, микобактерии, ерсинии) 3. Длительная персистенция в цитоплазме (хламидии, риккетсии) микроорганизм
Механизм персистенции хламидий Типичные включения, содержащие элементарные и ретикулярные тельца 48 часов после инкубации Патоморфологическая модель персистенции. После перенесенного теплового шока во Включениях меньших размеров содержатся крупные патологические формы хламидий
Макрофаг не презентирует основной АГ (MOMP) Экспрессия ранних Генных продуктов лизосома Антигенная перегрузка Гиперпродукция Ig A, G ГЗТ Антигенная мимикрия Сфингомиелинсодержащие экзоцитозные пузырьки, КГ hps 60 - белки теплового шока Липополисахарид. Не экспрессируется Состояние между Ретикулярными и Элементарными тельцами MOMP- не экспрессируется
+ Антифагоцитарная активность: 1. Плотная клеточная стенка элементарных телец (дисульфидные связи между структурами белка MOMP) 2. Прочность ретикулярных телец (полисахаридная капсула) «несостоятельность» Респираторного взрыва Активация СПОЛ и повреждение Мембран собственных клеток
ФНОα γИФ ИЛ-1 1. Усиление экспрессии АГ Клеточных мембран (ГКС, Fc) Активация фибробластов И эпителиальных клеток (непрофессиональные фагоциты) 2. Стимуляция ИЛ 1 и ИЛ 2 3. Активация фагоцитарной акт 4. Стимуляция выработки Ig 5. Индукция свободных радикалов
Медиаторы персистенции Chlamydia trachomatis Медиатор Эффект Низкие концентрации g -интерферона Резкое снижение количества эндогенного триптофана (активация фермента индоламин -2, 3 -диоксигеназы, расщепляющего триптофан до N-формилкинуренина) ФНО-a Дефицит эндогенного триптофана Опосредованный, путем активации b -ИФ (блокирует репродукцию внутриклеточных микроорганизмов, путем усиления экспрессии мембранных белков клеток) Необходим для построения МОМР Дефицит ц. ГМФ и высокое количество ц. АМФ Отсутствие активации ферментов необходимых для дифференциации РТ в ЭТ Дефицит и/или действие антагонистов Са 2+ Нарушение агрегации эндосомальных вакуолей
Медиаторы персистенции Chlamydia trachomatis (продолжение) L-изолейцин Эффект возможно обусловлен включением продукта метаболизма a -метилбутарила. Со. А в синтез жирных кислот С. trachomatis с последующим встраиванием "чужих" триглицеридов в клеточную мембрану, приводя к ее дестабилизации Дефицит цистеина Незаменима аминокислота, контролирующая дифференциацию РТ в ЭТ (включается в 3 важнейших для дифференциации белка), уменьшение числа дисульфидных мостиков факторов прочности клеточной стенки.
«Генетический дрейф» , или антигенная мимикрия: Аминокислотная последовательностиь 264 -286 главного сигма-фактора РНК-полимеразы хламидий (Chl. trachomatis). L 7 (пептид II), один из рибосомальных белков АТ Ревматические аутоиммунные заболевания
Персистенция Francisella tularensis цитохолазин-Внечувствительный путь Каспазы 3 и 9 TNF, IL 1 23 -k. Da эндосомы
+Антилизоцимная Антилактоферриновая Антикомплиментарная Активность ЛПС francisella tularentis S-ЛПС R-ЛПС Остаточная вирулентность вирулентные Низкая Чувствительность хозяина LPS-binding protein – LBP Инертный ЛПС Быстрая элиминация Высокая Чувствительность хозяина Гибель организма персистенция
Персистенция и адаптивный мутагенез в биопленках: Устойчивость биопленок к внешним воздействи ям характеризуют термином “персистенция” (от англ. persistence – выносливость, живучесть). Мертвые клетки
Значение персистенции в биопленках По данным Центра контроля заболеваний (CDC USA), около 65% всех инфекций обусловлено формированием в макроорганизме биопленок Образование биопленок на всех вводимых в макроорганизм медицинских устройствах (катеторы, протезы, стенты и тд); Образование биопленок на медицинском инструментарии…
бактерия + dna. J (синтез шаперона) у. E. coli pmr. C (синтез фосфолипидов) у. S. typhimurium Неблагоприятные условия Экспрессия SOS-генов Ген rmf, ингибитор трансляции Гены теплового и холодового шока rec. A, umu. DC, uvr. AB, sul. A Клетки-персистеры htr. A, htp. X, csp. H, clp. B, cbp. AB Гены системы «токсинантитоксин» din. J/yaf. Q, yef. M, rel. BE, maz. EF
Ген А Ген Т Ген Р антибиотик антитоксин рибосома Дефектный белок Нормальный белок Комплекс Т-А Нет синтеза белка персистенция
Основные токсины и место их приложения у E. Coli: токсин мишень активность Процесс Ccd B ДНК-гираза Двухцепочечные разрывы Репликация Rel E Транслирующие рибосомы Расщепление м. РНК Трансляция Maz F РНК Эндорибонуклеаза Трансляция Par E ДНК-гираза Двухцепочечные разрывы Репликация Doc Транслирующие рибосомы Расщепление м. РНК Трансляция Vap C РНК Эндорибонуклеаза Неизвестно Ξ-токсин Неизвестно Фосфотрансфераза Неизвестно Hip A EF-TU Протеинкиназа Трансляция Hip B Транслирующие рибосомы Расщепление м. РНК Трансляция
Сигма-фактор РНК-полимеразы Rpo. S Адаптивный мутагенез: ? “Адаптивными” называют мутации, которые возникают в медленно размножающейся или покоящейся популяции микроорганизма в период продолжительного стресса и которые противодействуют причинам, вызывающим данный стресс. Veillonella parvula Streptococcus mutans Устойчивость к антибиотикам
Lewis K. 2008 год считает, что главным способом борьбы с персистенцией в биопленках является «рассеянность пациентов» …
А. Г. Хоменко
Микобактерии туберкулеза могут попадать в организм различными путями: аэрогенно, энтерально (через желудочно-кишечный тракт), через поврежденную кожу и слизистые оболочки, через плаценту при развитии плода. Однако основным путем заражения является аэрогенный.
Определенную защитную роль при аэрогенном заражении играет система мукоциллиарного клиренса, позволяющая частично вывести попавшие в бронхи частицы пыли, капли слизи, слюны и мокроты, содержащие микроорганизмы. При энтеральном заражении определенное значение может иметь всасывающая функция кишечника.
Локальные изменения в месте внедрения микобактерий обусловлены прежде всего реакцией полинуклеарных клеток, которая сменяется более совершенной формой защитной реакции с участием макрофагов, осуществляющих фагоцитоз и разрушение микобактерий. Процесс взаимодействия легочных макрофагов с различными микроорганизмами, в том числе микобактериями туберкулеза, сложен и до конца не изучен. Результат взаимодействия макрофагов и микобактерий определяется состоянием иммунитета, уровнем ПЧЗТ, развивающейся в процессе туберкулезной инфекции, а также рядом других факторов, в том числе обусловливающих переваривающую способность макрофагов.
Фагоцитоз состоит из трех фаз: фазы соприкосновения, когда макрофаги с помощью рецепторов на клеточной мембране фиксируют микобактерии; фазы проникновения микобактерий внутрь макрофага путем инвагинации стенки макрофага и «окутывания» микробактерии; фазы переваривания, когда лизосомы макрофагов сливаются с фагосомами, содержащими микобактерии. Выделяющиеся в фа гол изосомы ферменты разрушают микобактерии. В процессе фагоцитоза важная роль принадлежит также механизмам перекисного окисления .
Микобактерии туберкулеза, как и некоторые другие микроорганизмы, попадая в макрофаги, могут сохраняться и даже продолжать размножение. В тех случаях, когда процесс переваривания микобактерий блокируется, происходят разрушение макрофагов и выход микобактерий из поглотивших их клеток.
Макрофаги, фагоцитировавшие микобактерии и осуществляющие их переваривание, выделяют во внеклеточное пространство фрагменты разрушенных микобактерий, протеолитических ферменты, медиаторы (в том числе интерлейкин-1), которые активируют Т- лимфоциты, в частности Т-хелперы.
Активированные Т-хелперы выделяют медиаторы - лимфокины (в том числе интерлейкин-2), под влиянием которых происходит миграция новых макрофагов к месту локализации микобактерий. Одновременно подавляется синтез фактора угнетения миграции, возрастает ферментативная активность макрофагов под влиянием фактора активации макрофагов. Активированные лимфоциты выделяют также кожно-реактивный фактор, который обусловливает воспалительную реакцию, повышение сосудистой проницаемости. С этим фактором связывают подавление ПЧЗТ и положительной туберкулиновой реакции [Медуницын Н. В. и др., 1980]. Кроме Т-хелперов, на состояние иммунитета значительно влияют Т-супрессоры и супрессорные моноциты, которые угнетают иммунный ответ.
Помимо Т-лимфоцитов и макрофагов, важная роль в патогенезе туберкулезного процесса принадлежит веществам, освобождающимся при разрушении микобактерий. Эти вещества (фракции) подробно изучены . Доказано, что корд-фактор (фактор вирулентности микобактерий туберкулеза, обусловливающий их рост на плотной питательной среде в виде «кос»), провоцирует острый воспалительный процесс, а сульфатиды повышают токсичность корд-фактора и, главное, подавляют образование фаголизосом в макрофагах, что предохраняет внутриклеточно расположенные микобактерии от разрушения.
При интенсивном размножении микобактерий в организме человека вследствие малоэффективного фагоцитоза выделяется большое число токсичных веществ, индуцируется резко выраженная ПЧЗТ, которая способствует появлению экссудативного компонента воспаления с развитием казеозного некроза и его размножения. В этот период увеличивается число Т-супрессоров, снижается число Т-хелперов, что приводит к угнетению ПЧЗТ. Это обусловливает прогрессирование туберкулезного процесса.
При сравнительно небольшой бактериальной популяции в условиях ПЧЗТ и эффективного фагоцитоза отмечается образование туберкулезных гранулем. Такая гранулема развивается в результате реакций ПЧЗТ [Авербах М. М. и др., 1974]. Скопление мононуклееров вокруг нейтрофилов, содержащих антиген, и их последующая трансформация происходят под регулирующим влиянием лимфокинов, вырабатываемых Т-лимфоцитами (в частности, Т-хелперами) и являющихся медиаторами гранулематозной реакции. Поскольку величина бактериальной популяции, а также характер течения иммунологических ракций на разных этапах туберкулезной инфекции меняются, морфологические реакции у заболевших туберкулезом характеризуются большим разнообразием.
В зависимости от места внедрения микобактерий туберкулеза воспалительный очаг, или первичный аффект, может образоваться в легких, ротовой полости, миндалинах, кишечнике и др. В ответ на образование первичного аффекта развивается специфический процесс в регионарных лимфатических узлах и формируется первичный туберкулезный комплекс. Установлено, что первичный туберкулез, развивающийся в результате первого контакта макроорганизма с возбудителем, может проявляться не только в виде первичного туберкулезного комплекса, как это считалось ранее. В результате первичного заражения возможно развитие туберкулеза внутригрудных лимфатических узлов, плеврита, туберкулемы, очагового процесса.
Первичный туберкулез в результате «свежего» заражения развивается лишь у 7-10% инфицированных лиц, остальные переносят первичную туберкулезную инфекцию без клинических проявлений. Наступившее заражение проявляется лишь в изменении туберкулиновых реакций.
Еще В. И. Пузик (1946), А. И. Каграманов (1954) и др. установили, что формированию первичного комплекса нередко предшествует период «латентного микробизма», при котором микобактерии туберкулеза, попадая в организм, какое-то время находятся в нем, не вызывая воспалительной реакции. При этом микобактерии чаще обнаруживаются в лимфатических узлах, особенно внутригрудных. В этих случаях локальные изменения в легких или других органах в виде очагов первичного туберкулеза возникают в поздний период первичной инфекции и не в месте проникновения микобактерий в организме, а в участках, наиболее благоприятных для развития туберкулезного воспаления.
Отсутствие клинико-морфологических проявлений первичной туберкулезной инфекции может быть объяснено высоким уровнем естественной резистентности к туберкулезу, а также может быть следствием приобретенного в результате вакцинации БЦЖ иммунитета.
При наличии локальных проявлений первичный туберкулез может протекать с развитием распространенного процесса по осложненному типу или, что в настоящее время наблюдается значительно чаще, по неосложненному типу с ограниченной воспалительной реакцией.
Как правило, первичный туберкулез заживает с небольшими остаточными изменениями, что, по-видимому, связано с высокой естественной резистентностью и проведением массовой вакцинации и ревакцинации БЦЖ.
Сохраняющиеся в остаточных очагах микобактерии или их измененные формы должны рассматриваться как туберкулезный антиген, наличие которого необходимо для поддержания сенсибилизированными лимфоцитами специфического иммунитета. Определенная, правда, еще малоизученная роль в поддержании противотуберкулезного иммунитета принадлежит В-клеточному иммунитету и генетическим механизмам.
Получены доказательства роли наследственности в течение туберкулезного процесса . Генетические факторы влияют на ответ иммунной системы при размножении микобактерий туберкулеза в организме человека и, в частности, определяют взаимодействие между макрофагами, Т- и В-лимфоцитами, продукцию лимфокинов, монокинов и других цитокинов Т- и В-лимфоцитами и макрофагами, комплексный иммунный ответ, от которого зависит чувствительность или устойчивость к развитию туберкулеза. Выявлено сцепление HLA-генотипов с заболеванием туберкулезом в семьях, в которых больны туберкулезом родители и дети.
Накопление некоторых специфичных типов HLA в группах больных с неблагоприятным течением болезни свидетельствует об ассоциации определенных генов HLA-комплекса (преимущественно локусов В и DR с предрасположенностью к туберкулезу) [Хоменко А. Г., 1985].
Период первичного инфицирования может завершиться излечением с минимальными (малыми) или довольно выраженными остаточными изменениями. У таких людей развивается приобретенный иммунитет. Сохранение в остаточных очагах персистирующих микобактерий не только поддерживает приобретенный иммунитет, но и одновременно создает риск эндогенной реактивации туберкулезного процесса вследствие реверсии измененных форм возбудителя туберкулеза в бактериальную форму и размножения микобактериальной популяции.
Реверсия персистирующих форм микобактерий в размножающиеся происходит в условиях эндогенной реактивации туберкулезных очагов и других остаточных изменений. Механизм эндогенной реактивации, а также развитие туберкулезного процесса изучены недостаточно.
В основе реактивации лежат прогрессирующее размножение бактериальной популяции и увеличение количества микобактерий [Хоменко А. Г., 1986]. Однако до настоящего времени остается неизвестным, что именно и какие условия способствуют реверсии возбудителя туберкулеза, находившегося в персистирующем состоянии. Установлено, что реактивация туберкулеза и развитие различных его клинических форм чаще наблюдаются у лиц с остаточными изменениями при наличии факторов, снижающих иммунитет.
Возможен и другой путь развития вторичного туберкулеза - экзогенный, связанный с новым (повторным) заражением микробактериями туберкулеза (суперинфекция). Но и при экзогенном пути развития вторичного туберкулеза недостаточно проникновения микобактерий в уже инфицированный организм даже при массивной повторной суперинфекции. Необходима совокупность ряда условий и факторов риска, снижающих иммунитет. Вторичный туберкулез характеризуется большим разнообразием клинических форм.
Основные разновидности патоморфологических изменений в легких и других органах характеризуются:
- очагами с преимущественно продуктивной тканевой реакцией, благоприятным, хроническим течением и тенденцией к заживлению;
- инфильтративно-пневмоническими изменениями с преимущественно экссудативной тканевой реакцией и тенденцией к развитию казеозного некроза или рассасыванию возникшей воспалительной реакции;
- туберкулезной каверной - результатом разложения образовавшихся казеозных масс и их отторжения через дренажные бронхи с образованием полости распада.
Различные сочетания основных патоморфологических изменений туберкулеза создают предпосылки для чрезвычайно большого разнообразия туберкулезных изменений, особенно при хроническом течении болезни со сменой периодов обострения и затихания процесса. К этому нужно добавить, что из сформировавшихся зон поражения микобактерии могут распространяться с током лимфы или крови в непораженные участки и различные органы. Исход болезни зависит от ее течения - прогрессирующего или регрессирующего, эффективности лечения и обратимости изменений, сформировавшихся в процессе болезни.
Доказано, что в условиях голодания и даже при недостаточном питании, особенно когда в рационе недостаточное количество белков и витаминов, нередко возникает реактивация туберкулеза. К факторам, способствующим реактивации , относятся и различные заболевания: сахарный диабет, лимфогранулематоз, силикоз, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, состояние после резекции желудка и двенадцатиперстной кишки, хронические воспалительные заболевания легких, психические заболевания, протекающие с депрессивным синдромом, алкоголизм, стрессовые ситуации, СПИД, длительный прием глюкокортикоидов, цитостатиков и иммунодепрессантов.
Течение и исходы туберкулеза следует рассматривать только в условиях проводящейся специфической химиотерапии, которая применяется всем больным активным туберкулезом. В процессе химиотерапии отмечается уменьшение популяции микобактерий вследствие разрушающего влияния химиопрепаратов на возбудителей туберкулеза. Вследствие этого резко снижается число микобактерий, создаются более благоприятные условия для репара тивных процессов и саногенеза.
Вместе с тем при применении самых эффективных комбинаций современных химиопрепаратов отмечается разное течение туберкулезного процесса: регрессия с последующим заживлением, стабилизация процесса без клинического излечения с сохранением каверны, туберкулемы или других изменений, временное затихание воспалительного процесса с последующим возникновением обострения, развитием хронического процесса или прогрессированием заболевания.
Таким образом, уменьшение популяции микобактерий под влиянием специфических химиопрепаратов далеко не всегда приводит к излечению. Прекращение туберкулезного процесса и последующее излечение зависят не только от уменьшения популяции микобактерий, но и от способности репаративных процессов организма обеспечить регрессию туберкулезного процесса и его прекращение. Туберкулезное воспаление
Патоморфологические изменения в органах и тканях при туберкулезе многообразны и зависят от формы, стадии, локализации и распространенности патологического процесса.
Общими для большинства форм туберкулеза являются специфические изменения в сочетании с неспецифическими или параспецифическими реакциями. К специфическим изменениям относится туберкулезное воспаление, течение которого сопровождается формированием туберкулезного бугорка, или гранулемы, и более крупного очага. Неспецифическими изменениями являются различные реакции, обусловливающие так называемые маски туберкулеза.
Морфология туберкулезного воспаления зависит от реактивности организма и вирулентности возбудителя. В туберкулезном очаге могут преобладать явления экссудации, некроза или пролиферации, и очаг в соответствии с этим может быть преимущественно экссудативным, невротическим или продуктивным. В развитии туберкулезного воспаления большая роль принадлежит иммунологическим процессам.
В участке воспаления сначала развивается реакция, не имеющая признаков, типичных для туберкулеза. В ней в разной степени выражены явления альтерации и экссудации. На первое место выступают нарушения в микроциркуляторном русле. Они затрагивают тонкую структуру стенки альвеолы, и механизмы их развития можно проследить на ультраструктурном уровне [Ерохин В. В., 1987]. На ранних стадиях воспаления изменения в субмикроскопической организации составных элементов стенки альвеолы связаны с повышением капиллярной проницаемости, развитием внутриклеточного интерстициального и внутриальвеолярного отека с вымыванием отечной жидкостью альвеолярного сурфактанта.
В дальнейшем дистрофические изменения в альвеолярной ткани нарастают, однако наряду с ними возникают и компенсаторно-восстановительные процессы, направленные на развитие внутриклеточной организации, повышение функциональной активности сохраняющихся клеток межальвеолярной перегородки. В следующей фазе воспаления - пролиферативной - появляются специфические для туберкулеза элементы (эпителиоидные и гигантские клетки Пирогова-Лангханса), формируются участки своеобразного гомогенного казеозного (творожистого) некроза в центре туберкулезного очага.
На основании данных электронной микроскопии и авторадиографии о динамике клеточной трансформации установлена генетическая связь клеток гранулемы по линии моноцит - гигантская клетка [Серов В. В., Шехтер А. Б., 1981; Ерохин В. В., 1978, 1987; Danneberg А. М., 1982; SpectorW-G., 1982]. Макрофаги активно синтезируют и накапливают лизосомные ферменты, выполняют фагоцитарную функцию. Поглощенный материал, среди которого находятся и микобактерии туберкулеза, находится и переваривается в фагосомах и фаголизосомах.
Эпителиоидные клетки образуются из мононуклеаров и макрофагов, скапливающихся в очаге туберкулезного воспаления в первые фазы воспалительной реакции. Они имеют крупное ядро овальной формы, обычно с 1-2 ядрышками. Цитоплазма этих клеток содержит митохондрии, гранулы, аппарат Гольджи, хорошо развитую систему канальцев и цистерны зернистой и незернистой цитоплазматической сети, единичные фагосомы небольших размеров. Число митохондрий, элементов ретикулума, лизосомных включений широко варьирует и определяется функциональным состоянием клетки.
Гигантские клетки Пирогова-Лангханса могут образовываться из эпителиоидных клеток или макрофагов при их пролиферации, а также в результате слияния эпителиоидных клеток. Цитоплазма гигантских клеток содержит большое число ядер, обычно располагающихся в виде кольца или подковы по периферии клеток, множество митохондрий, лизосом, элементов зернистой цитоплазматической сети, хорошо развитый комплекс Гольджи. Гигантские клетки способны к фагоцитозу, в их цитоплазме обнаруживаются различные остаточные включения Они характеризуются высокой активностью гидролитических и дыхательных ферментов.
Помимо эпителиоидных и гигантских клеток, туберкулезная грануляционная ткань обычно содержит значительное число лимфоидные и плазматических клеток, а также нейтрофильный лейкоцитов. В периферических отделах грануляционного слоя выявляются фибробласты. Вокруг очага воспаления нередко имеется перифокальная зона неспецифической воспалительной реакции. При прогрессирования процесса наблюдаются увеличение казеозного некроза, усиление инфильтрации грануляционной ткани мононуклеарами и лимфоидными клетками, а также нейтрофилами, расширение зоны перифокального воспаления. Специфический процесс распространяется контактным и лимфатическим путем.
При заживлении туберкулезного очага массы казеозного некроза уплотняются, в последних отмечается отложение мелких зерен солей кальция. В грануляционной ткани увеличивается количество фибробластов и фибрилл коллагена, объединяющихся в коллагеновые волокна, которые вокруг туберкулезного очага формируют соединительнотканную капсулу. В последующем специфическая грануляционная ткань все больше замещается фиброзной тканью. Число клеточных элементов между коллагеновыми волокнами уменьшается, иногда коллагеновые волокна подвергаются гиалинозу.
В подобных очагах и посттуберкулезных очагах обнаружены измененные формы микобактерий туберкулеза, в частности L-формы, что позволяет лучше понять роль старых туберкулезных очагов в патогенезе вторичных форм туберкулеза [Пузик В. И., Земскова 3. С., Дорожкова И. Р., 1981, 1984]. В основе реактивации туберкулеза и формирования различных форм вторичного туберкулеза легких лежат реверсия и размножение бактериальной популяции на фоне развития недостаточности специфической и неспецифической защиты микроорганизма.
Неспецифические или параспецифические реакции могут формироваться в различных органах и тканях: нервной и сердечно-сосудистой системе, кроветворных органах, суставах, серозных оболочках и др. В сердечно-сосудистой системе и паренхиматозных органах указанные реакции проявляются очаговой или диффузной гистиоцитарной и лимфоцитарной инфильтрацией, в лимфатических узлах - пролиферацией ретикулярных и эндотелиальных клеток, в легких - образованием лимфоидных узелков. А. И. Струков (1959) считает, что эти реакции имеют токсико-аллергическую природу.
В. И. Пузик (1946) расценивает их как результат действия микобактерий туберкулеза в ранние периоды развития инфекционного процесса. Показана связь данных реакций с клеточным и гуморальным иммунитетом [Авербах М. М., 1976].
Благодаря профилактическим противотуберкулезным мероприятиям и специфическому лечению наблюдается значительный патоморфоз туберкулеза . К истинному патоморфозу относят уменьшение числа казеозных пневмоний (что свидетельствует о повышении иммунитета), более частое образование туберкулем. Реже стали встречаться формы милиарного туберкулеза и туберкулезного менингита (особенно у детей).
Проявлениями индуцированного патоморфоза, обусловленного специфическим лечением, являются изолированные каверны, вокруг которых быстро рассасывается перифокальное воспаление, полное рассасывание или развитие мелких звездчатых рубчиков при гематогенно-диссеминированном туберкулезе, отторжение казеозно-некротических масс с формированием на месте каверны кистоподобной полости при фиброзно-кавернозном туберкулезе.
Применение наиболее эффективных химиопрепаратов приводит к полному излечению от туберкулеза. Чаще наблюдается разное течение туберкулезного воспаления: стабилизация и обратное развитие, приобретение хронического характера с периодами затихания и обострения специфического процесса. Решающее значение принадлежит макроорганизму, состоянию его защитных механизмов, способности противостоять действию антигенного раздражителя, а также развитию полноценных репаративных процессов.
Клинико-морфологические проявления первичного инфицирования микобактериями туберкулеза принято называть первичным туберкулезом. Первичный туберкулез развивается лишь у 7-10% инфицированных лиц, чаще детей, у остальных же заражение проявляется лишь виражом туберкулиновых проб [Хоменко А. Г., 1989]. Отсутствие клинических проявлений первичного заражения объясняется высоким уровнем неспецифической и специфической резистентности к туберкулезу, развившейся в результате противотуберкулезной вакцинации БЦЖ.
Организм справляется с туберкулезной инфекцией, пройдя период возникновения «малых» неспецифических и специфических реакций. В результате организм приобретает иммунитет к туберкулезу и болезнь не развивается. В настоящее время реже, чем раньше, наблюдается хроническое течение первичной туберкулезной инфекции в виде разнообразных параспецифических реакций, или «масок туберкулеза».
Наиболее частой формой первичного туберкулеза является бронхоаденит, нередко протекающий без казеинфикации лимфатических узлов и формирования очагов в легких. При снижении сопротивляемости организма и более массивного инфицирования в лимфатических узлах развивается специфическое воспаление с образованием очагов творожистого некроза. Изменения распространяются на капсулу и прилежащие участки легкого, при этом формируется прикорневой инфильтрат, как правило, неспецифической природы. Процесс может переходить на стенки бронхов с образованием микрофистул.
При заживлении в лимфатических узлах наблюдаются рассасывание перифокального воспаления, уплотнение казеоза, отложение солей кальция в казеозе, нарастание фиброзных изменений в капсуле и окружающей прикорневой области.
Первичный туберкулез может проявляться формированием в легком первичного туберкулезного очага. Этот очаг имеет пневмонический характер с казеозом в центре и широкой перифокальной зоной воспаления снаружи. Вслед за формированием легочного аффекта отмечается поражение регионарных лимфатических узлов с «дорожкой» из измененных лимфатических сосудов между ними. Это соответствует картине первичного комплекса с его тремя составными компонентами.
При заживлении перифокальное воспаление рассасывается, казеоз в очаге уплотняется, откладываются соли кальция, а вокруг очага формируется соединительнотканная капсула. Может произойти полное замещение казеозного очага фиброзом. В лимфатических узлах преобладают процессы инкапсуляции и обызвествления казеозных масс.
В случае прогрессирования первичного комплекса пневмонический фокус увеличивается в размерах, подвергается казеинфикации с формированием острых пневмониогенных каверн. Вокруг каверны затем формируется соединительнотканная капсула, и процесс переходит в фиброзно-кавернозный туберкулез.
Прогрессирующее течение первичного туберкулеза может проявиться в виде милиарного туберкулеза в результате «прорыва» инфекции в кровеносное русло. Важно помнить о возможности острой диссеминации инфекции; необходимо своевременно диагностировать подобные случаи, так как рано начатое лечение дает хороший эффект.
Следовательно, периоду первичного заражения наряду с распространением инфекции по лимфатическим путям присущи и гематогенные отсевы, характеризующие бациллемию с возникновением очагов специфического воспаления в различных органах и тканях. Очаги-отсевы в легких, формирующиеся в различные периоды первичного туберкулеза, нередко являются случайной находкой при рентгеноанатомическом обследовании людей, не страдающих активными формами туберкулеза.
Такие очаги состоят из казеоза, окруженного фиброзной капсулой, бедной клеточными элементами. Очаги, как правило, множественные, располагаются в верхних сегментах легких под плеврой. С обострения процесса в этих очагах начинается вторичный туберкулез, характеризующийся локальным поражением органа. Таким образом, послепервичным очагам принадлежит большое значение в патогенезе вторичного туберкулеза.
Введение
На протяжении многих столетий ученые исследовали микробные популяции и механизмы их формирования, и только в конце прошлого века столкнулись с особой формой организации бактериальных культур - сообществом микроорганизмов, способных колонизировать объекты окружающей среды и существовать не только в виде микропланктона, но и специфически организованных биоплёнок. Биоплёнки - подвижные, постоянно изменяющиеся гетерогенные сообщества (Чеботарь, 2012), которые могут быть образованы бактериями одного или нескольких видов и состоять как из активно функционирующих клеток, так и из покоящихся или некультивируемых. Формирование подобных высокоспециализированных сообществ - одна из основных стратегий выживания бактериальных культур не только в окружающей среде, но и в организме человека. В целом, биоплёнки представляют собой группу микробных клеток, окруженных толстым, состоящим из высокомолекулярных веществ слизистым слоем.
Механизм формирования биоплёнок
Обычно микроорганизмы существуют в виде свободно плавающих масс или единичных колоний, но некоторые представители бактериального царства стремятся прикрепиться к определенному субстрату-поверхности и образовать биоплёнку, механизм образования которой сложен, строго регулируем и включает четыре последовательные стадии.
1 этап: обратимое (первичное) прикрепление к поверхности. Первый этап формирования биопленки характеризуется обратимой адгезией, связанной с действием неспецифических физико-химических сил между молекулами и структурами на поверхности микроорганизмов (элементами клеточной стенки, жгутиков, пилей) и твёрдого субстрата за счёт различных взаимодействий: Ван-дер-Вальсовых, гидрофобных, ионных, электростатических;
2 этап: необратимое прикрепление к поверхности. После адсорбции бактериальная клетка перемещается вдоль поверхности субстрата, прочно связываясь с ним посредством факторов адгезии, а также с помощью неполимерных адгезинов, которые различают структурные элементы поверхностей тканей хозяина - коллаген, эластин, гликопротеины, гиалуроновую кислоту. На этом же этапе, помимо прочного прикрепления к субстрату, происходят: потеря бактериями подвижности, межклеточные взаимодействия, обмен генами между микроорганизмами как одного, так и разных видов.
3 этап: созревание - maturation 1 . После прочного прикрепления к субстрату и обмена генами прикрепившиеся бактерии начинают синтезировать экзополисахаридный окружающий матрикс, известный как внеклеточное полимерное вещество (extracellular polymeric substance ), который является предохранительной «слизью» и составляет 85% всей зрелой биопленки (Чеботарь, 2012; Фролова, 2015). Этот матрикс способствует образованию первоначальной биоплёнки из мелких колоний бактерий. Компоненты экзополисахарида варьируют в зависимости от того, какие микроорганизмы являются его частью.
4 этап: рост - maturation 2 . На данном этапе образуется зрелая биоплёнка, после чего наступает пора вторичных колонизаторов, то есть клеток, которые прикрепляются к бактериям, уже локализованным на поверхности (Афиногенова, 2011).
Зрелые биопленки способны терять единичные фрагменты, которые, распространяясь по макроорганизму, прикрепляются к субстратам и образуют новые биопленки. Кроме того, в зрелых биоплёнках бактерии не делятся, так как окружены плотным матриксом, и сохраняют высокую жизнеспособность.
Формирование биоплёнки происходит достаточно быстро. Присоединение бактерий друг к другу происходит за несколько минут, прочно связанные колонии образуются за 2−4 часа, а выработка внеклеточного полимерного вещества происходит в течение 6−12 часов, после чего бактерии, образующие биоплёнку, становятся в значительной степени толерантными к антибиотикам, дезинфицирующим веществам, антисептикам. Кроме того, биоплёнки быстро восстанавливаются после механического воздействия (Чеботарь, 2012).
Ультраструктура биоплёнок
Ультраструктура биоплёнок установлена с помощью конфокальной сканирующей лазерной микроскопии. Внеклеточный матрикс микробных клеток имеет специфическое строение и образован трёхмерными грибовидными или колонноподобными структурами. Выделяемый на этапе созревания биопленок экзополисахарид представлен двуслойным гетерополисахаридом, универсальным для каждого вида микроорганизмов. Его наружный слой содержит полисахариды в гидратированном состоянии (декстран, гиалуроновую кислоту, целлюлозу), а внутренний наполнен мембранными везикулами, которые способны выступать в роли факторов патогенности (такие везикулы содержат щелочную фосфатазу С, протеазы, лизоцим). Вещества везикул также выполняют функцию лизиса ослабленных бактериальных клеток, фрагменты которых в дальнейшем являются ростовым фактором и источником питания для остальных членов биопленки.
Все составляющие матрикса разделены каналами, по которым осуществляется транспорт питательных веществ, кислорода, а также выделение конечных продуктов метаболизма бактериальных клеток. За образование и сохранение таких транспортных каналов несут ответственность поверхностные структуры - рамнолипиды, состоящие из смеси полисахаридов, белков, нуклеиновых кислот и других веществ.
В матриксе биопленки также находится экстрацеллюлярная ДНК, которая участвует в процессах адгезии, межклеточных взаимодействиях и обуславливает специфику существования биопленочных сообществ (Тец, 2012).
Морфология клеток, входящих в состав биоплёнки
С помощью электронной микроскопии установлено, что на начальных этапах формирования биопленки морфология микроорганизмов не меняется (Фролова, 2015). На последующих, более поздних этапах, бактериальные структуры приобретают морфологическую специфику, связанную с прикрепленным состоянием и коллективным сосуществованием. Кроме того, у клеток в составе биоплёнки происходит замена поверхностных структур, увеличивается частота обмена генетическим материалом между особями в сообществе, деформируется ультраструктурная организация.
Свойства и роль в защите бактериальных популяций
Биопленки являются одним из наиболее значимых факторов защиты, существенно повышая толерантность бактерий к стрессовым ситуациям (нехватка кислорода и питательных веществ в условиях голодания), к факторам иммунной системы человеческого организма, к действию внешних условий (антибиотики, дезинфекторы, стерилизация). Такая толерантность способствует приобретению абсолютной резистентности к факторам, которые могли бы уничтожить бактерий, находись они в свободном состоянии.
Защитная роль биопленок заключается в следующих свойствах:
- Свойство барьера. Биоплёнки предотвращают глубокое проникновение в их матрикс крупных молекул и клеток, вызывающих воспаление, и служат диффузным барьером для маленьких антимикробных агентов;
- Совокупные защитные свойства. Бактерии (как одного, так и разных видов) способны обмениваться факторами защиты (продуктами метаболизма или генами), то есть осуществлять взаимозащиту. Так, бактерии одного вида, резистентные к действию антибиотиков, могут передавать гены, ответственные за резистентность, бактериям другого вида, к данному антибиотику чувствительным, обеспечивая таким образом повышение их устойчивости к действию фактора;
- Свойство обмена, обеспечивающее передачу между микроорганизмами, входящими в состав одной биоплёнки, генов и продуктов жизнедеятельности (Чеботарь, 2012; Тец, 2012);
- Свойство бездействия, то есть образование неподвижных (неактивных, неметаболизирующих, спящих) субпопуляций - ключевое свойство, присущее исключительно биоплёнкам. Для того чтобы антибиотик подействовал на микроорганизм, он должен быть метаболически активным. Поэтому неактивные бактерии в биоплёнках являются наиболее устойчивыми к подобного рода воздействиям (Тец, 2012; Фролова, 2015).
Разнообразие систем регуляции биоплёнкообразования
Клетки в составе межклеточного матрикса обладают « чувством кворума» (quorum sensing ) - способностью передавать информацию и регулировать свое поведение за счёт секреции сигнальных молекул. Другими словами, это система регуляции, находящаяся внутри биоплёнки. Известно три системы, которые отличаются друг от друга природой аутоиндукторов:
- Используется преимущественно грамотрицательными бактериями, а в качестве сигнальных молекул выступают ацилированный лактон гомосерина, который связывается с белком-регулятором, взаимодействующим с двумя регуляторными ферментами - люциферазой и гомосерин-лактоно-синтазой. Активация регуляторных белков индуцирует создание микробами кластеров биоплёнки (Тец, 2012; Туркутюков, 2013).
- Характерна для грамположительных бактерий и функционирует с использованием линейных и циклических форм пептидов, фуранов, лактонов, их производных, секретируемых во внешнюю среду. Одни из них взаимодействуют с мембраносвязывающими сенсорными киназами, которые проводят сигнал через мембрану, другие транспортируются в клетку с помощью пермеаз, где связываются с внутриклеточными рецепторами. Сигнальным механизмом таких систем является каскад фосфорилирования-дефосфорилирования. Информационные молекулы взаимодействуют с двухкомпонентными системами, в состав которых входит сигнальный белок киназа, связанный с мембраной. Киназа определяет информационный пептид, а затем фосфорилирует и активирует белок-регулятор, связывающийся с ДНК и регулирующий транскрипцию. Сигнальные пептиды этой системы закодированы в хромосоме, а рецепторные белки - в плазмидах. Таким образом, с помощью подобной коммуникации транслоцируются плазмиды, несущие гены устойчивости к антибиотикам, гены гемолизинов, бактериоцинов и гены вирулентности.
- Встречается у всех микроорганизмов, а сигнальные молекулы представлены бутиролактоном, хинолом, гидроксикетонами, люциферазой. У бактерий есть рецепторные сенсорные белки, которые связывают аутоиндукторы, образуя комплекс, взаимодействующий с мембраносвязанной киназой. Киназа фосфорилируется, фосфат переносится на цитоплазматический белок, затем на регуляторный белок, который связывается с ДНК. В дальнейшем происходит активация генов, кодирующих регуляторные РНК, что ведет к прекращению экспрессии компонентов клеточных структур, реализующих внутривидовые межклеточные коммуникации.
Такая сложная система регуляции, основанная на продукции сигнальных молекул-индукторов, осуществляется на разных уровнях воздействия: транскрипционном, трансляционном, посттрансляционном. Благодаря «чувству кворума» в популяции биоплёнки постоянно происходит два вида селекции - положительная и отрицательная, то есть сохраняются клетки с выгодными свойствами и уничтожаются бактерии с «ненужными» фенотипами (Тец, 2012).
Участие ТА системы (система токсин-антитоксин) в образовании биоплёнки
Говоря о биоплёнках, стоит отметить, что не каждый микроорганизм способен к их образованию. Процесс синтеза экзополисахаридного матрикса обусловлен определенными факторами. Согласно последним результатам исследования Страсбургского университета им. Луи Пастера можно утверждать, что для образования биоплёнки необходимо наличие специализированного белка. К примеру, для образования сообщества Staphylococcus aureus необходимо наличие SasG-белка (в комплексе с Zn 2+). SasG-белок представляет собой РНК-связывающий белок, который активизирует:
1) рост поверхностных структур бактерий - жгутиков, пилей;
2) синтез внеклеточных полисахаридов;
3) обеспечивает формирование толерантности.
За секрецию SasG-белка отвечает набор двух или более тесно связанных генов, которые в совокупности кодируют и белок, и соответствующий ему блокатор.
Данная система получила название TA-модуль. Она локализована в плазмиде. Это достаточно сложная система, которая обеспечивает не только возможность бактерий образовывать биоплёнки, но и обеспечивает ее жизнеспособность в целом. Согласно работе (Yamaguchi, 2011), если дочерняя клетка лишена плазмиды, то нестабильный антитоксин (блокатор), унаследованный с цитоплазмой материнской клетки, разрушается, а стабильный токсичный белок убивает клетку.
Помимо этого, ТА-модуль отвечает за:
1) регуляцию генов: некоторые токсины действуют как общие репрессоры экспрессии генов, в то время как другие более специфичны;
2) контроль роста: как отмечалось, бактериостатические токсины не убивают клетку-хозяина, а ограничивают её рост;
3) устойчивость клетки: в некоторых популяциях бактерий имеется субпопуляция клеток, обладающая устойчивостью к действию множества классов антибиотиков. Субпопуляция контролируется системами токсин-антитоксин. Эти медленнорастущие выносливые клетки страхуют популяцию от полного вымирания.
4) программируемую гибель клетки и выживание её «близких родственников» - различный уровень устойчивости клеток популяции к стрессовым условиям, обусловливающий программируемую гибель некоторых клеток, которая предотвращает вымирание всей популяции (погибшая клетка становится источником питания для остальных).
5) противодействие бактериофагам: когда бактериофаг нарушает транскрипцию и трансляцию клеточных белков, активация систем токсин-антитоксин ограничивает репликацию фага.
Клинический аспект изучения биоплёнок
В настоящее время достоверно доказана роль микробных биоплёнок в возникновении и развитии многих инфекционных заболеваний. Это инфекции сердечных клапанов и суставных протезов, инфекции раневых поверхностей. Раны представляют собой идеальный субстрат для микробной контаминации с последующим образованием биоплёнок. Биоплёнки в ране создают среду с определённым микроклиматом, для которого характерно низкое содержание кислорода. Биопленки задерживают миграцию и пролиферацию кератиноцитов, ингибируя тем самым защитные иммунные механизмы, а снаружи создают защитный слой, непроницаемый для противомикробных препаратов местного действия (Чеботарь, 2012а).
Характерными биоплёночными инфекционными патологиями являются гингивиты (воспаление десен), стоматиты (воспаление слизистой рта), образование зубного камня. Отиты - наиболее часто встречающаяся отоларингологическая проблема - также сопровождаются образованием биоплёнок, причем не только бактериальных, но и грибковых.
Помимо раневых инфекций, биоплёнки играют роль в хронизации заболеваний мочевыделительной системы, катетер- и имплант-ассоциированных инфекций (катетеры, водители ритма, сердечные клапаны, ортопедические устройства), заболеваний ССС (синуситах, эндокардитах). Иными словами, биоплёнки играют важнейшую роль в патогенезе широкого спектра как поверхностных, так и глубоких инфекционных заболеваний. Все эти заболевания трудны для лечения, имеют высокую частоту рецидивов и некоторые из них могут явиться причиной летальных исходов.
При подозрении на наличие биоплёнкообразующих микроорганизмов in vivo учитываются следующие факторы:
1) отслоение биоплёнок в кровотоке или мочевыводящем тракте может приводить к формированию эмболов;
2) биоплёнки грамотрицательных бактерий могут продуцировать эндотоксин (липополисахарид), что ведет к инфекционно-токсическому шоку и ДВС-синдрому;
3) бактерии в биоплёнках могут обмениваться плазмидами резистентности (передача резистентности от вида к виду);
4) бактерии в биоплёнке не поддаются воздействию иммунной системы хозяина;
5) биопленки могут снижать чувствительность бактерий к антимикробному агенту.
Последние три пункта указывают на то, что биоплёнки обладают высокой резистентностью к антибиотикам. Однако относительно них более уместно употребить термин толерантность. Примером возникновения феномена толерантности может служить SasG-белок Staphylococcus aureus . Его биосинтез провоцирует сбой в пострепликационном цикле, при котором нарушается функционирование бактериального фермента гиразы (аналог топоизомеразы-4 у бактерий). Это приводит к возникновению персистеров.
Персистеры - уникальные клетки бактериальных сообществ, которые, обладая тем же набором генов, что и остальные микроорганизмы сообщества, многократно устойчивы к внешним факторам в отличие от окружающих их клеток (Ульянов, 2014). Персистеры отличаются от обычных бактерий своей физиологией: даже в благоприятных условиях они формируют вокруг себя экзополисахаридный матрикс, часто растут гораздо медленнее обычных бактерий, и, как уже было сказано, отличаются высокой резистентностью к внешним факторам. Персистеры составляют небольшую часть бактериального сообщества, но их количество возрастает в стационарной фазе роста. Интересно, что дочерние клетки обладают такой же резистентностью к внешним факторам, как и родительские клетки-персистеры.
Рассмотрим механизм резистентности персистеров. Предположим, что на бактериальную колонию действует внешний фактор - например, антибиотик. Антибиотик ингибирует активность гиразы (топоизомеразы-4), в результате чего в бактериальной клетке возникают двуцепочечные разрывы ДНК, но только в тех участках, где гираза активна, то есть, в районе «репликативной вилки». Если клетки защищены внеклеточным полимерным веществом, и количество таких мест не больше двух-четырех, то клеточные системы защищают бактерию от гибели, восстанавливая повреждения. У обычных быстрорастущих бактериальных клеток подобных разрывов много и ДНК при применении антибиотика деградирует, в то время как ДНК персистеров сохраняется. Действие антибиотиков может быть различным, но они все встречаются с одной и той же проблемой: медленно развивающиеся, хорошо защищённые персисторы менее подвержены стрессу и успевают «законсервироваться», прежде чем им будет нанесен необратимый ущерб.
Приведенная информация не исчерпывает данных об особенностях микробных биоплёнок. Следует отметить, что, несмотря на большой теоретический материал и важность проблемы, остаются нерешёнными вопросы, связанные с биоплёнкообразующей активностью патогенных и условно патогенных микроорганизмов в составе нозокомиальной микрофлоры медицинских стационаров различного профиля. Отсутствуют препараты, обладающие эффективностью против биоплёнок и микрофлоры в составе внеклеточных матриксов, а также средства борьбы со зрелыми биоплёнками. Эта проблема требует дальнейших разработок.
Библиография
1. Yamaguchi Y., Inouye M. Regulation of growth and death in Escherichia coli by toxin-antitoxin systems. Nature Reviews Microbiology 2011, 9(11):779-790.
2. Афиногенова А.Г., Доровская Е.Н. Микробные биопленки ран: состояние вопроса // Травмотология и ортопедия. – 2011. – №3. – С.119–125.
3. Балко А.Б., Балко О.И., Авдеева Л.В. Формирование биопленки штаммами Pseudomonas aeruginosa // Микробиологический журнал. – 2013. – №2. – С.50–56.
4. Мальцев С.В., Мансурова Г.Ш. Что такое биопленка? // Практическая медицина. – 2011. – №53. – С.7–10.
5. Тец В.В., Тец. Г.В. Микробные биопленки и проблемы антибиотикотерапии // Практическая пульмонология. – 2013. – №4. – С. 60–64.
6. Туркутюков В.Б., Ибрагимова Т.Д., Фомин Д.В. Молекулярные особенности морфологии биопленок формируемых штаммами неферментирующих грамнегативных бактерий // Тихоокенский медицинский журнал. – 2013. – №4. – С.44–47.
7. Ульянов В.Ю., Определенцева С.В., Швиденко И.Г., Норкин И.А., Коршунов Г.В., Гладкова Е.В. Биологическая кинетика биопленок клинических штаммов Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa, выделенных у больных с бронхолегочными осложнениями при травматической болезни спинного мозга // Клиническая лабораторная диагностика. – 2014. – №8. – С.43–47.
8. Фролова Я.Н. Биологические свойства биопленок токсигенных штаммов Corinobacterium Diphtheriae gravis TOX + : дис. … канд.биол.наук: 12.06.2015 / Фролова Яна Николаевна. – Ростов, 2015. – 118 с.
9. Чеботарь И.В. Механизм антибиопленочного иммунитета // Вестник Российской академии медицинских наук. – 2012. – Т.67. – №12. – С.22–29.
10. Чеботарь И.В., Кончалова Е.Д., Бугрова М.Л. Везикулярные структуры в системе «Нейтрофил – Биопленка Staphylococcus aureus» // Инфекционная иммунология. – 2012а. – №61. – С.35–39.
Персистирующая инфекция – это заболевание, которое вызывается бактериями, обитающими в человеческом организме. Некоторые из них не представляют угрозы для здоровья, но другие – несут постоянную угрозу, а потому защитные механизмы организма тщательно контролируют их размножение. Длительное пребывание таких «спящих» агентов – это и есть причина болезни.
Что это за инфекции?
Обращаясь к медицинской терминологии, персистенция – это способность микроорганизмов, которые вызывают инфекцию, долго прибывать в организме человека без проявления клинических симптомов. При этом они способны при определенных условиях к активации, что провоцирует развитие инфекционного заболевания.Механизм, который запускает развитие или активацию персистирующей инфекции, напрямую зависит от состояния здоровья человека – от того, насколько его организм силен, чтобы блокировать скрытую инфекцию.
Персистирующая инфекция может иметь латентную форму, что означает бессимптомное протекание инфекции, не сопровождающаяся выделением во внешнюю среду. При латентной форме инфекцию или вирус не удается обнаружить с помощью привычных диагностических мер, которые применяются в медицине.
Под влиянием внешних факторов, персистирующая инфекция может выходить и проявляться клинически. К таким факторам можно отнести:
- снижение иммунитета (дополнительно читайте, );
- сильный стресс;
- переохлаждение;
- снижение защитных функций организма на фоне другого заболевания.
Возбудители инфекции
Не все микроорганизмы способны существовать в организме человека и при этом «не выдавать себя». Вирусы, которые могут персистировать, обязательно должны обладать таким свойством, как внутриклеточное существование в микроорганизме. В число таких агентов входят:
- хламидии;
- микоплазмы;
- хеликобактер;
- вирусы группы герпесвируса;
- гепатит;
- токсоплазмы.
Хроническая персистирующая инфекция может поражать любые клетки организма и проявиться только в случае, если человек уже перенес инфекцию ранее. В организме возбудитель инфекции остается в латентной форме и обостряется тогда, когда у человека снижаются защитные функции организма.
В группе риска хронической персистирующей инфекции находятся следующие лица:
- доноры крови;
- недоношенные дети;
- беременные;
- онкобольные;
- медицинский персонал;
- пациенты с иммунодефицитом.
Течение острых инфекций отличается от течения инфекционных процессов, которые вызывают персистирующие вирусы. Например, если острая инфекция (грипп, корь и т. д.) проявляет себя сразу же, то персистирующие инфекции протекают хронически с возможными вспышками паталогических процессов. Так, у персистирующих инфекций есть две формы – латентная (ремиссия) и обостренная (когда вирус активируется).
Воспалительный процесс, который вызывает персистирующая инфекция, приводит к изменениям во всех системах организма: морфологическим, метаболическим, структурным. Это отражается на органах и их работе.
В латентной форме распознать скрытую инфекцию самостоятельно невозможно, так как нет никаких признаков, которые указывали бы на нее. В таких случаях затрудняется даже диагностика. А вот хроническая персистирующая инфекция подает некоторые сигналы. Всё зависит от того, где именно локализовался очаг воспаления. Например, при поражении органов мочеполовой системы пациенты жалуются на такие проявления:
- болезненное мочеиспускание;
- учащенное мочеиспускание;
- мутный цвет мочи или же наличие в ней кровяных сгустков или гноя.
- озноб;
- лихорадку;
- слабость и боль в мышцах (вплоть до полной невозможности встать с постели);
- увеличение селезенки;
- спутанность сознания.
Важно понимать, что по таким признакам сложно поставить точный диагноз, а саму скрытую инфекцию можно и вовсе упустить из виду.
Диагностика и лечение
Только лабораторные исследования могут подтвердить наличие или отсутствие хронической персистирующей инфекции. Это:- цистоскопическое исследование биологического материала (соскоб из уретры, исследования мочи и слюны) – позволяет обнаружить характерные клетки персистирующего вируса;
- молекулярно-биологическая диагностика – помогает выявить вирусный ДНК геном;
- иммуноферментный анализ – помогает обнаружить специфические антитела.
- Терапию противовирусными препаратами (Фоскарнет, Ганцикловир).
- Терапия иммунными средствами. Она нужна потому, что часто персистирующая инфекция переходит в острую форму на фоне иммунодефицита.
Персистирующая инфекция – очень сложная патология, которая у каждого пациента протекает индивидуально, поэтому важен такой подход в лечении, который основан на состоянии здоровья пациента и его общей истории болезни.
Особенности инфекции у детей
Поскольку детский организм слаб и окончательно крепнет только в период подросткового созревания, он очень уязвим для развития персистирующей инфекции. Особенно подвержены вирусным болезням новорожденные и дети в возрасте до 10 лет.Дети могут «подхватить» персистирующую инфекцию двумя способами:
- от другого больного человека или животного, при контакте с инфекционной средой;
- из внешней среды, так как детский организм никак не препятствует вирусу, который свободно входит в благоприятную среду и там размножается.
Выявить вирусное заболевание можно по следующим признакам:
- жар (температура от 38 до 40 градусов);
- непрекращающаяся головная боль;
- вялость;
- отсутствие аппетита;
- сильное потоотделение;
- боль в мышцах;
- тошнота и рвота.
- лихорадка;
- охриплость или полная потеря голоса;
- кашель;
- заложенность носа и выделение гноя из пазух.
- придерживаться меню, обогащенного фруктами, овощами и молочными продуктами;
- постараться сбить температуру – малышам до года можно поставить свечку, а малышам старше года можно дать Ибупрофен для детей.
Исследование реверсии протопластов бактерий и грибов выявило сходство протекания у них данного процесса. Условно он может быть разделен на три этапа: 1) регенерация клеточной стенки, 2) реверсия, появление клеток-ревертантов, 3) восстановление нормального цитокинеза и появление клеток исходной формы.
Вместе с тем каждой группе микроорганизмов присущи свои особенности протекания реверсии протопластов, связанные со строением клеток и клеточных стенок, характером метаболизма и цитокинеза.
Реверсия бактериальных протопластов . Если при обработке лизоцимом или пенициллином в изотонической среде клеточная стенка с бактериальной клетки полностью не удалена, то при исключении этих агентов из среды происходит быстрое восстановление клеток. Если же клеточная стенка удалена полностью, образовавшийся истинный протопласт неспособен в обычных условиях ее регенерировать. Одним из условий, позволяющих таким формам ревертировать к исходному состоянию, является наличие в среде культивирования твердой или полутвердой основы. Ею может быть желатина (5-30%), агар (0,7-2%), мембранные фильтры, убитые бактериальные клетки или клеточные стенки. Причем использование твердого субстрата предпочтительнее.
Реверсия протопластов мицелиальных грибов . Реверсия к мицелиальным формам у грибных протопластов происходит как в жидкой, так и на поверхности твердой среды, или в слое полужидкого агара. Многие исследователи показали, что реверсия грибных протопластов может проходить тремя способами, различающимися характером формирования первичного мицелия. При первом способе протопласты первоначально образуют цепочку из дрожжеподобных клеток (до 20 клеток). Затем терминальная, уже осмотически устойчивая, продуцирует первичную гифу, образующую мицелий. Второй способ реверсии начинается с регенерации протопластами клеточной стенки, вследствие чего они становятся резистентными к осмотическому шоку. После чего протопласт образует зародышевую трубку. Третий способ реверсии грибных протопластов необычен. Протопласт, сохраняя сферическую форму, формирует новую оболочку в виде полочки, затем туда переносится содержимое материнского протопласта. Если появляется цепочка таких оболочек, то цитоплазма передвигается по этой цепочке, оставляя позади себя "тени" из клеточных стенок. Последняя клетка цепочки образует первичную гифу. Грибные протопласты могут ревертировать одним из трех способов, или у одного вида наблюдается все три способа реверсии. Трудно сказать, что влияет на выбор способа реверсии, возможно, видовые особенности организма, тип его цитокинеза, метод получения и условия инкубации протопластов или состав регенерационной среды.
Растущие и ревертирующие протопласты - хорошая модель для изучения биосинтеза клеточной стенки и взаимоотношений между ростом и ядерным делением клетки.
4.2. Культивирование растительных клеток
Идея возможности культивирования клеток вне организма была высказана еще в конце XIX века. Период с 1892 по 1902 гг. можно считать предысторией развития метода культуры клеток и тканей растений. В это время немецкие ученые Х. Фехтинг, К. Рехингер, Г. Габерландт предпринимали попытки выращивать изолированные из растений кусочки тканей, группы клеток, волоски. Не достигнув экспериментальных успехов, эти первые исследователи, однако высказали ряд идей, реализованных позднее.
В последующие 20 лет были получены первые результаты по культивированию тканей животных на питательных средах с добавлением сывороток. Но в растительном мире каких-либо значительных успехов достигнуть не удалось, не смотря на попытки создания оптимальных питательных сред, способных обеспечивать длительное существование и размножение клеток растений in vitro.
В 1922 году В. Роббинс и Котте независимо показали возможность культивирования на синтетических питательных средах клеток меристемы кончика корня томатов и кукурузы. Эти опыты положили начало применению метода культивирования изолированных клеток и органов растений.
В 30-60-е годы, благодаря работе большого числа ученых (Ф. Уайт, Р. Готре и другие), число видов растений, клетки и ткани которых выращивали in vitro, достигло значительного количества (более 150). Были описаны составы питательных сред, определены потребности культур в витаминах и стимуляторах роста, разработаны методы получения и выращивания больших масс клеточных суспензий, а также культивирования отдельной, выделенной из суспензии клетки. Ф. Стюард, работая с культурой изолированной флоэмы моркови, получил из нее в 1958 году целые растения. Значительный вклад в развитие культуры клеток и тканей растений внесли исследования Р. Г. Бутенко и ее сотрудников, использовавших эти методы для изучения физиологии растительных клеток и морфогенеза растений.
В последующие годы были предложены методы получения изолированных протопластов из растительных тканей, найдены условия культивирования, при которых они способны образовывать новую клеточную стенку, делиться и давать начало клеточным линиям. С использованием изолированных протопластов были разработаны методы гибридизации соматических клеток путем слияния протопластов с помощью ПЭГ (полиэтиленгликоля) и введения в них вирусных РНК, клеточных органелл, клеток бактерий. С помощью метода культуры меристем были получены безвирусные экономически важные растения с высоким коэффициентом размножения.
В настоящее время активно продолжается разработка методов глубинного культивирования клеток, методов электрослияния изолированных протопластов и т. д.
Использование методов получения сомаклональных вариантов, экспериментальных гаплоидов, скрининга биохимических мутантов привели к появлению более продуктивных и приспособленных к условиям культивирования клеточных штаммов, используемых для создания новых форм и сортов сельскохозяйственных, лекарственных, декоративных и других растений.
